基础研究
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世界华人消化杂志. 2005-09-28; 13(18): 2188-2192
Published online 2005-09-28. doi: 10.11569/wcjd.v13.i18.2188
改良聚合酶链反应检测HBV共价闭合环状DNA
汤勃, 王宇明, 刘俊, 张瑞
汤勃, 王宇明, 刘俊, 张瑞, 第三军医大学西南医院全军感染病研究所 重庆市 400038
汤勃, 男, 1973-04-16生, 安徽省宣城市人, 汉族, 2003年第三军医大学博士, 主治医师, 主要从事肝炎病毒分子生物学研究.
基金项目: 国家自然科学基金资助项目, No. 30230320.
通讯作者: 汤勃, 400038, 重庆市沙坪坝区西南医院感染科. botang@mail.tmmu.com.cn
电话: 023-65461189-8044
收稿日期: 2005-07-19
修回日期: 2005-07-24
接受日期: 2005-07-28
在线出版日期: 2005-09-28
Abstract

目的: 建立一种基于聚合酶链反应(PCR) 的简便快速、具有较高敏感性和特异性的检测乙型肝炎病毒(HBV)共价闭合环状DNA(cccDNA)的方法.

方法: 分别提取HepG2.2.15细胞内的cccDNA及培养上清中的松驰环DNA(rcDNA)样品, 试剂盒纯化; 设计2对特异性引物, 其扩增区域跨越rcDNA单链区; 设计2对非特异性引物, 扩增区域位于rcDNA双链区. 经单链特异性绿豆芽核酸酶(MBN)分别消化cccDNA及rcDNA样品; 以特异性引物和非特异性引物对消化前后的两种样品分别进行PCR扩增, 并改变PCR扩增参数如底物数量、循环次数等, 观察特异性引物能否顺利扩增消化后的cccDNA, 同时又不扩增消化后的rcDNA. HBV基因组质粒样品作为对照. 此外还采用实际乙型肝炎患者体内病毒样本检验此策略的实用性.

结果: 分别以非特异性引物和特异性引物扩增不同模板数的HBV rcDNA样品, 2对非特异性引物可扩增出模板数在102以上的HBV rcDNA样品, 2对cccDNA特异性引物也可以扩增出模板数在104以上的样品. 特异性引物在PCR反应模板数较多时将不能区分消化前的rcDNA和cccDNA. 不同数量HBV cccDNA和rcDNA模板在MBN消化前后, 分别应用非特异性引物和特异性引物进行PCR扩增, 发现不同数量的cccDNA模板分子经过MBN消化后, 仍可用特异性引物和非特异性引物扩增出相应条带; rcDNA样品经过MBN消化后, 非特异性引物可扩增出产物条带, 而特异性引物无法扩增出条带. 采用此种策略, 我们发现慢性乙肝患者血清HBV核酸样品主要成份为rcDNA, 并带有少量cccDNA, 而肝细胞内HBV核酸样品富含cccDNA, 与实际情况一致.

结论: 联合应用MBN选择性消化和cccDNA特异性引物的PCR检测法简便快速, 敏感性和特异性均较满意.

Keywords: 肝炎病毒, 乙型; 共价闭合环状DNA; 聚合酶链反应; 绿豆芽核酸酶