Published online 2005-07-28. doi: 10.11569/wcjd.v13.i14.1658
修回日期: 2005-04-07
接受日期: 2005-04-09
在线出版日期: 2005-07-28
目的: 通过Maxizyme 胞外、胞内及整体水平对肝癌突变抑癌基因p53的抑制作用, 为肝癌的基因治疗探索一条新途径.
方法: 应用计算机设计针对人肝癌突变抑癌基因p53(mtp53)249位密码子的Maxizyme(Mz)和对照大酶asMz, 应用分子克隆技术构建核酶的细胞外转录载体和真核表达载体. 应用RiboMAXTM large Scale RNA production systems胞外转录出核酶和靶基因, 进行细胞外切割反应, 检测大酶对mtp53的切割作用, 同时检测对野生型p53(wtp53)是否具有切割作用. 在脂质体 LipofectamineTM2000的介导下稳定转染含有突变型p53, 且突变位点在249位密码子的人肝癌细胞MHCC97, 应用Northern Blot,Western Blot等方法检测大酶在细胞内的表达及对肝癌细胞mtp53的抑制作用. 建立人肝癌裸鼠皮下移植瘤模型, 将荷瘤裸鼠随机分为空白对照组、空载体组和基因治疗组. 观察肿瘤生长情况并记录动物死亡时间, 绘制肿瘤生长曲线和生存期图. RT-PCR检测mtp53mRNA表达水平的变化.
结果: 成功构建核酶基因并将其正确克隆入细胞外转录载体pBSKU6和真核载体pEGFPC1中. Mz在细胞外具有良好的切割靶基因mtp53活性, 切割效率为49%, 而对野生型p53无切割作用, asMz对突变型p53及野生型p53均无明显切割作用. 在脂质体LipofectAMINETM2000的介导下成功转染肝癌细胞MHCC97, 嵌于U6表达系统中的Mz在细胞内高效表达. Northern Blot检测证实pEGFPMz组mtp53的mRNA水平明显下调, Mz在细胞内的切割效率为65%. Western Blot结果提示基因治疗组mtp53的蛋白表达明显下降, 切割效率为67%. 动物试验证实Mz可减慢裸鼠肿瘤生长速度,Mz治疗组荷瘤鼠生存期明显延长. PT-PCR检测到Mz治疗组裸鼠肿瘤组织mtp53的mRNA水平明显下调(mtp53 mRNA: 0.95±0.13 vs 1.44±0.14, 1.47±0.12; P<0.05).
结论: Mz可有效切割mtp53, 抑制其mRNA和蛋白质的表达, 有效抑制肝癌细胞的生长.