基础研究
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世界华人消化杂志. 2005-07-15; 13(13): 1554-1557
Published online 2005-07-15. doi: 10.11569/wcjd.v13.i13.1554
人内皮抑素endostatin基因的融合表达纯化及活性测定
杨芳, 何援利, 刘芸
杨芳, 何援利, 南方医科大学珠江医院妇产科 广东省广州市 510282
刘芸, 中山大学生命科学院医药分子生物学实验室 广东省广州市 510275
杨芳, 女, 1975-09-18生, 山西省高平市人, 汉族. 主治医师, 2002年南方医科大学硕士生, 主要从事肿瘤治疗的研究.
基金项目: 广东省科技厅科技计划项目资助课题, No. 2003B30502.
通讯作者: 何援利, 510282, 广东省广州市工业大道中253号, 南方医科大学珠江医院妇产科. fangfangy2003@yahoo.com.cn
电话: 020-61643361
收稿日期: 2005-03-22
修回日期: 2005-03-28
接受日期: 2005-04-08
在线出版日期: 2005-07-15
Abstract

目的: 获得有活性的人内皮抑素(endostatin)融合蛋白.

方法: 从人胎肝组织中提取总RNA,经逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出endostatin基因, 定向克隆重组入pTRX表达载体, 转化大肠杆菌BL21(DE3), IPTG诱导表达, 纯化, MTT法测定endostatin蛋白对人脐带静脉血管内皮细胞的抑制活性.

结果: RT-PCR获得endostatin基因, 扩增产物在10 g/L琼脂糖凝胶上显示为1条扩增条带, 约573 bp, 与预计大小一致.将PCR产物连入PGEM-T载体, 转化大肠杆菌DH5α, 阳性克隆经KpnI, NotI酶切鉴定、测序验证.构建pTRX-endo表达载体, 在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达, 经SDS-PAGE分析, 出现特异性蛋白质条带, 大小与预期相符合.重组蛋白经纯化, MTT法测定重组人内皮抑素蛋白具有生物学活性.人脐静脉血管内皮细胞(ECV304)受到明显抑制, 具有剂量依赖抑制关系, ED50 = 550 μg/L.

结论: 人内皮抑素基因在原核细胞表达载体pTRX中获得成功表达, 表达蛋白能够抑制人脐静脉血管内皮细胞(ECV304)的增殖.

Keywords: 人内皮抑素基因; 融合表达; 活性; 逆转录-聚合酶链反应; MTT法