基础研究
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世界华人消化杂志. 2005-07-15; 13(13): 1535-1539
Published online 2005-07-15. doi: 10.11569/wcjd.v13.i13.1535
应用抑制性消减杂交技术筛选三氧化二砷对肝细胞调节的差异表达基因
吴顺华, 成军, 郑玉建, 张跃新, 刘妍, 郭江, 张黎颍, 王国荃
吴顺华, 成军, 刘妍, 郭江, 张黎颍, 北京地坛医院传染病研究所 北京市 100011
吴顺华, 郑玉建, 张跃新, 王国荃, 新疆医科大学公共卫生学院环境与基因研究室 新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054
吴顺华, 男, 1974-09-12生, 宁夏固原市人, 汉族, 2004年新疆维吾尔自治区医科大学博士, 副教授, 主要从事环境与基因、病毒性肝炎的发病机理研究.
基金项目: 国家自然科学基金攻关项目, No. C03011402, No. C30070689; 军队"九五"科技攻关项目, No. 98D063; 军队回国留学人员启动基金项目, No. 98H038; 军队"十五"科技攻关青年基金项目, No. 01Q138; 军队"十五"科技攻关面上项目, No. 01MB135.
通讯作者: 成军, 100011, 北京安东城区安外大街地坛公园13号, 北京市地坛医院传染病研究所. cj@genetherapy.com.cn
电话: 010-64481639 传真: 010-64281540
收稿日期: 2004-09-07
修回日期: 2005-04-18
接受日期: 2005-05-25
在线出版日期: 2005-07-15
Abstract

目的: 应用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization, SSH)技术构建As2O3处理的人肝癌细胞系HepG2差异表达基因的cDNA消减文库, 筛选并克隆As2O3调节相关基因, 阐明As2O3对肝细胞调节作用的分子生物学机制.

方法: 以As2O3处理HepG2细胞, 同时以PBS处理的相同细胞系作为对照; 24 h后制备细胞裂解液, 提取mRNA并逆转录为cDNA, 经RsaI酶切后, 将实验组cDNA分成两组, 分别与两种不同的接头衔接, 再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性多聚酶链反应(PCR), 将产物与T/A载体连接, 构建cDNA消减文库, 并转染大肠杆菌J109进行文库扩增, 随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.

结果: 成功构建三As2O3处理HepG2细胞差异表达基因的cDNA消减文库. 文库扩增后得到109个白色克隆, 进行菌落PCR分析, 均得到200-1 000 bp插入片段. 挑取含有插入片段的36个克隆进行测序, 并通过生物信息学分析获得15种已知基因序列和6个未知功能的新基因.

结论: 应用SSH技术成功构建了As2O3处理HepG2细胞差异表达基因的cDNA消减文库.

Keywords: 肝癌; As2O3; 抑制性消减杂交; 多聚酶链反应; 克隆