包载反义RNA重组腺病毒微球的制备及逆转肝癌的体内外效果

Abstract

目的: 构建携带反义多药耐药相关蛋白(MRP)基因的重组腺病毒微球, 了解包载反义RNA重组腺病毒微球逆转肝细胞癌MRP的治疗效果.

方法: 采用可降解的生物材料聚乳酸-聚乙烯醇(PELA)包被携带反义MRP基因的重组腺病毒制成微球, 体外测定微球的粒径、载病毒量、包封率及释放规律, 并用其转染人肝癌耐药细胞株HepG₂/ADM, 48 h及120 h后检测转染细胞荧光强度. MTT法检测耐药细胞的阿霉素半数致死量(IC₅₀); 流式细胞仪检测细胞内红色荧光强度; 以β-actin为内参照, 以RT-PCR法观察转染后MRPmRNA表达量的高低. 观察经肝动脉注射rAdV微球后肿瘤体积大小、生长率及平均生存时间.

结果: 成功构建了携带反义MRP基因的重组腺病毒微球, 直径约1.765 μm, 包封率为52.4%, 载病毒率为5.5×10¹¹efu/g, 在120 h内释放病毒量接近50%, 总的释放时间长于240 h. 释放出的病毒保持活性, 10 mg微球48 h对HepG₂/ADM耐药细胞株转导效率可达90%以上. HepG₂/ADM细胞48 h及120 h阿霉素IC₅₀为9.72, 4.15 μg; 以HepG₂细胞内DNR的荧光强度为对照, rAdv微球组转染后120 h与HepG₂/ADM及rAdv组比较, 细胞内DNR浓度有所升高(168.6±6.97 vs 98.39±6.17; 168.6±6.97 vs 112.52±9.21, t = 13.68及9.69, P = 0.001及0.001<0.01). 诱导后HepG₂/ADM MRP高表达, 转染Adv微球后48 h及120 h, MRPmRNA的表达强度较转染前明显降低, 以120 h表达最弱. 转染Adv微球后120 h与48 h相比, MRPmRNA/βactin的比值分别较转染前降低16.7%及63.6%; 120 h较转染AdV48 h表达降低26.25%. 治疗组 vs 对照组, 生理盐水组, 空白微球组及rAdv组(n = 4), 肿瘤生长率显著降低(0.96±0.25 vs 8.79±0.34; 4.82±0.30; 4.67±0.67; 2.97±0.29, t = 36.10, 24.43, 12.28及13.81, P = 0.0001, 0.0009, 0.001及0.001<0.05). 平均生存时间显著延长(43.6±7.4 vs 23.4±3.2; 25.3±3.7; 26.5±4.1; 33.7±2.9, t = 5.521, 4.599, 4.522, 2.796, P = 0.005, 0.007, 0.007及0.049<0.05).

结论: 聚乳酸-聚乙烯醇共聚物(PELA)包载反义RNA重组腺病毒制备的微球, 可有效抑制MRP的表达提高耐药细胞对化疗药物的敏感性, 这为高分子化学与基因治疗的结合提供了临床应用的理论基础.

Keywords: 反义RNA; 重组腺病毒; 微球; 肝细胞癌, 多药耐药相关蛋白