修回日期: 2004-06-09
接受日期: 2004-06-17
在线出版日期: 2004-09-15
目的: 利用转基因技术将HepG2细胞改建为具有生理性胰岛素分泌能力的"胰岛代理细胞".
方法: 以携葡萄糖激酶(glucokinase, gk)基因的逆转录病毒及携人胰岛素原基因突变体(mutant proinsulin gene, mpin)的逆转录病毒共同感染肝母细胞瘤细胞系HepG2, G418选择培养基挑选抗性细胞集落, 放免法、SDS-PAGE、Western-blot及反转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)鉴定HepG2细胞中两个目的基因的转录及表达; 选取联合表达葡萄糖激酶及成熟胰岛素的HepG2细胞进行葡萄糖反应性胰岛素分泌的检测, 以单独表达成熟胰岛素的HepG2细胞作对照.
结果: 在G418选择培养基中3 wk获阳性细胞克隆, 采用放免法、SDS-PAGE、Western-blot从20个细胞克隆中挑选出联合表达葡萄糖激酶及成熟胰岛素的HepG2细胞4株, 其中1株2个目的基因表达均较强, 命名为细胞克隆"b"; 经RT-PCR检测证实细胞"b"中已有两个目的基因的转录. 在细胞"b"中, 葡萄糖浓度为0.5 mmol/L和0.75 mmol/L时, 胰岛素的分泌无显著性差异(P >0.05); 葡萄糖浓度为2.0 mmol/L, 3.0 mmol/L, 4.0 mmol/L, 5.0 mmol/L及6.0 mmol/L时, 胰岛素的分泌无显著性差异(P >0.05); 其余葡萄糖浓度条件下, 胰岛素的分泌差异均有显著性意义(P <0.05). 在单独表达胰岛素的HepG2细胞中, 各葡萄糖浓度条件下, 胰岛素的分泌均无显著性差异(P >0.05). 说明在细胞"b"中获得了葡萄糖反应性胰岛素分泌, 葡萄糖浓度约1.75-2 mmol/L时出现胰岛素分泌高峰.
结论: 成功构建了具有生理性胰岛素分泌能力的"胰岛代理细胞"系.