修回日期: 2004-04-11
接受日期: 2004-04-20
在线出版日期: 2004-08-15
目的: 初步筛选和鉴定大肠癌转移相关基因, 阐述大肠癌转移的分子机制.
方法: 利用抑制消减杂交技术(suppression subtractive hybridization, SSH), 在一对来自同一亲本、转移能力不同的人大肠癌细胞株SW620和SW480间, 已成功构建了人大肠癌转移促进基因和转移抑制基因的两个cDNA消减文库. 从以上两个文库中随机挑取约200个菌液PCR片段, 利用Differential screening(DS)方法筛选真正差异表达的cDNA片段, 之后通过Northern blot对部分差异cDNA片段的DS筛选结果进行验证. 最后对筛选出的差异cDNA片段进行测序和同源检索, 分析其性质并初步探讨其在大肠癌中转移中的可能机制.
结果: 约200个菌液PCR片段经过DS筛选后, 共获得29个真正差异表达cDNA片段, 利用Northern blot对其中4种cDNA片段的表达情况进行验证, 结果与DS筛选一致. 然后对29个差异cDNA片段进行测序和同源性分析, 得到25个差异表达基因, 10个为已知基因, 其中5个基因在高转移细胞株SW620中差异表达, 可能有促进转移的作用, 包括热休克蛋白10(heat shock protein10, HSP10)、细胞色素氧化酶II (cytochrome C oxidaseII, COXII)、有丝分裂调控蛋白dis3人同源物(mitotic control protein dis3 homolog, DIS3)、骨骼肌α1-肌动蛋白(skeletal muscle actin alpha1, ACTA1)及血浆淀粉样蛋白A(serum amyloid A, SAA); 另外5个基因的表达仅见于在SW480低转移细胞株, 具有潜在的转移抑制作用, 包括egl nine homolog 2 (EGLN2)、真核翻译起始因子4A(eukaryotic translation initiation factor 4A, EIF4A)、人细胞色素氧化酶III的类似物(similar to cytochrome c oxidase III, COXIII)、谷胱甘肽S转移酶3(glutathione S-transferase mu 3, GSTM3) 及线粒体DNA(mitochondrion DNA, mtDNA). 10个已知基因基本上是一些与细胞生长分化、代谢合成、转录、凋亡及信号转导等相关的基因. 除DIS3和SAA外, 其余基因与大肠癌转移的关系在本研究中首次被报道. 此外, 还筛选到15个未知基因片段, 通过与人基因组序列进行比对, 发现其中6个基因定位于5号染色体上, 包括4个可能促进大肠癌转移的基因和2个抑制基因. 目前这15个未知基因片段已经被GeneBank dbEST库收录, GeneBank登陆号为CD485499-CD485513.
结论: DS技术是一种筛查表达文库的有效途径; 细胞的生长分化、转录、凋亡、信号转导等变化可能在大肠癌转移过程中发挥重要作用; 5号染色体上可能存在多个与大肠癌转移相关的新基因位点.