肝癌
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世界华人消化杂志. 2004-08-15; 12(8): 1785-1788
Published online 2004-08-15. doi: 10.11569/wcjd.v12.i8.1785
肝癌相关cDNA片段的快速克隆和表达
赵弘智, 梁平, 李靖, 李洪艳, 黄小兵
赵弘智, 梁平, 李靖, 李洪艳, 黄小兵, 中国人民解放军第三军医大学新桥医院肝胆外科 重庆市 400037
赵弘智, 男, 1972-10-15生, 山西省大同市人, 汉族, 2002年第三军医大学博士研究生, 主要从事肝癌及胆管癌方面的临床和实验研究.
基金项目: 国家自然科学基金资助项目, No. 30170424.
通讯作者: 李靖, 400037, 重庆市, 中国人民解放军第三军医大学新桥医院肝胆外科. xqyylijing@163.net
电话: 023-65384825
收稿日期: 2004-03-05
修回日期: 2004-03-20
接受日期: 2004-03-24
在线出版日期: 2004-08-15
Abstract

目的: 克隆原发性肝癌相关新基因.

方法: 利用抑制消减杂交法(suppression subtractive hybridi-zation, SSH)已经发现了1条新的肝癌相关基因片断表达序列标签(EST), 长447 bp, 经Genebank检索, 90%无同源性. 在其保守序列区设计了2条用于3'Race扩增的寡聚核苷酸引物(3'GSP2: 5'-CGCATAGTACCAGTATCGACAAAGG-3', 3'NGSP2: 5'-TCCACATTACGGACCCGACGGATT-3'), 利用cDNA末端快速扩增法(RACE)进一步克隆该基因的全长cDNA序列. 人原发性肝癌细胞株HepG2, 体外传代培养, 培养基为RPMI1640培养基. 提取HepG2总RNA, 方法参照SV Total RNA Isolation System的说明进行. RACE法扩增采用Clontech公司的Smart TM Race cDNA Amplification Kit. 将3'RACE-PCR扩增的目的片段以Race自带的产物纯化试剂盒进行纯化、回收, 然后将其克隆到PMD 18-T Vector中, 提纯质粒后进行酶切鉴定, 确认质粒内有插入片段, 由宝生物工程(大连)有限公司协助完成测序. 将克隆所得cDNA片段用NCBI提供的BLASTN与GeneBank的dbEST、nr数据库进行同源性比较, 确认代表新基因的EST并且登录GeneBank (http://www.ncbi.nlm.nih.Gov/submission). 3例病理标本取自西南医院肝胆科, 病理证实均为原发性肝细胞肝癌, 分别提取肝癌及远端正常肝组织总RNA. 将酶切回收的克隆插入片段分别进行同位素标记获得cDNA探针, 利用Clontech公司的ExpressHybTM杂交液通过RNA印记法检测克隆片段在肝癌及正常肝组织中的表达, 方法参照ExpressHybTM Hybridization Solution user manual说明进行. 同时, 利用互联网的基因表达分析序列数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SAGE)(series analysis of gene expression, SAGE)对基因的表达及其表达水平进行分析, 从而确定其组织的分布.

结果: 得到5条3'EST(694 447-3, 724 447-3, 697 447-3, 711 447-3, 692 447-3; 大小500-550 bp), 5条3'EST均已登录GeneBank(登录号: CK730344, CK730345, CK730346, CK730347, CK730348). 对其中2条带有poly-A尾的3'EST(694 447-3, 724 447-3), 进行序列分析后, 发现他们是代表新基因或不同剪接体的EST, 且具有共同的保守序列. RNA印记分析显示694 447-3, 724 447-3在3例肝癌组织中的表达强度明显高于对应的正常肝组织. 通过SAGE文库分析基因的表达谱, 发现694 447-3和724 447-3在神经系统肿瘤、结肠癌、胃癌、乳腺癌肿瘤文库的表达高于对应的正常组织文库.

结论: 克隆所得的2条带有poly-A尾的3'EST可能是新的肝癌多基因家族成员. 利用 RACE技术可以快速、高效的克隆疾病相关基因.

Keywords: N/A