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SV40T外显子的拼接及逆转录病毒载体pLLTSN的构建
李俊刚, 陈耀凯, 王宇明, 中国人民解放军第三军医大学西南医院全军感染病研究所 重庆市 400038
李俊刚, 男, 1975-06-10生, 贵州省平坝县人, 汉族. 2001年第三军医大学硕士生, 主要从事生物人工肝细胞材料的研究.
基金项目: 国家自然科学基金资助项目 , No. 30100080 ; 全军医学"十五"计划面上项目 , No. 01MA177 .
通讯作者: 陈耀凯, 400038, 重庆市, 中国人民解放军第三军医大学西南医院全军感染病研究所. yaokaichen@hotmail.com
电话: 023-68754475-8006 传真: 023-65397072
收稿日期: 2003-12-10
修回日期: 2004-01-09
接受日期: 2004-02-01
在线出版日期: 2004-05-15
修回日期: 2004-01-09
接受日期: 2004-02-01
在线出版日期: 2004-05-15
Abstract
目的: 为构建肝细胞永生化载体, 对猿猴病毒40大T抗原基因(SV40T)外显子进行拼接并以其为外源片段构建逆转录病毒永生化载体pLLTSN.
方法: 以质粒pUC19-SV40T为模板, 高保真PCR扩增SV40T的2个外显子, 重叠延伸拼接法将两个外显子拼接到一起, 然后用双粘端连接法将其克隆到空载体pLXSN的EcoRⅠ和BamHⅠ位点之间, 通过菌落PCR和酶切法筛选, 鉴定阳性克隆并经DNA测序验证.
结果: 拼接成2.1 kb的SV40T, 用菌落PCR和酶切法随机筛选的10个菌落中4个为阳性, 均含有2.1 kb SV40T插入片段. 经质粒DNA测序分析的阳性克隆, 确证无内含子.
结论: 获得重组的2.1 kb无内含子的SV40T, 成功构建了逆转录病毒载体pLLTSN.
Keywords: N/A