病毒性肝炎
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世界华人消化杂志. 2004-04-15; 12(4): 843-846
Published online 2004-04-15. doi: 10.11569/wcjd.v12.i4.843
应用抑制性消减杂交技术克隆和筛选丙型肝炎病毒NS3蛋白反式激活基因1的反式调节基因
纪冬, 成军, 王建军, 刘妍, 杨倩, 党晓燕, 王春花
纪冬, 成军, 王建军, 刘妍, 杨倩, 党晓燕, 王春花, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心、全军病毒性肝炎防治研究重点实验室 北京市 100039
纪冬, 男, 内蒙古自治区人, 医师, 毕业于第一军医大学, 现为军医进修学院内科传染病专业2002级硕士学位研究生, 主要从事传染病临床及病毒性肝炎的基础研究.
基金项目: 国家自然科学基金资助项目, No. C03011402, No. C30070689, No. C39970674, No. C30371288; 军队"九、五"科技攻关项目, No. 98D063; 军队回国留学人员启动基金项目, No. 98H038; 军队"十、五"科技攻关青年基金项目, No. 01Q138; 军队"十、五"科技攻关面上项目, No. 01MB135.
通讯作者: 成军, 100039, 北京市西四环中路100号, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心、全军病毒性肝炎防治研究重点实验室. cj@genetherapy.com.cn
电话: 010-66933392 传真: 010-63801283
收稿日期: 2003-11-13
修回日期: 2003-12-01
接受日期: 2003-12-16
在线出版日期: 2004-04-15
Abstract

目的: 筛选与克隆丙型肝炎病毒(HCV)NS3反式激活基因1的反式激活基因, 了解其可能存在的调节功能线索.

方法: 应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学(bioin-formatics)技术筛选并克隆NS3TP1反式激活的新型靶基因. 以NS3TP1表达质粒pcDNA3.1(-)-NS3TP1转染HepG2细胞, 以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照, 制备转染后的细胞裂解液, 提取mRNA并逆转录为cDNA, 经Rsa I酶切后, 将实验组cDNA分成两组, 分别与两种不同的接头衔接, 再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应(PCR), 将产物与pGEM-Teasy载体连接, 构建cDNA消减文库, 并转染大肠杆菌进行文库扩增, 随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.

结果: 成功构建人NS3TP1反式激活基因差异表达的cDNA消减文库. 文库扩增后得到68个阳性克隆, 进行菌落PCR分析, 均得到200-1 000 bp插入片段. 随机挑选其中36个插入片段测序, 并通过生物信息学分析获得其全长基因序列, 结果共获得23种编码基因, 其中3个为未知功能的新基因.

结论: 筛选到的cDNA全长序列, 包括一些与细胞生长调节、物质代谢、免疫及细胞凋亡密切相关的蛋白编码基因, 推测了NS3TP1可能存在的调控机制的线索.

Keywords: N/A