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应用酵母双杂交技术筛选肝细胞cDNA文库中乙型肝炎病毒前-X蛋白结合蛋白基因
刘敏, 王琳, 成军, 邵清, 张健, 杨倩, 董菁, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心、全军病毒性肝炎防治研究重点实验室 北京市 100039
张树林, 西安交通大学第一医院传染科 陕西省西安市 710061
刘敏, 女, 1969-02-19生, 陕西省西安市人, 主治医师, 西安交通大学2000年内科学在读博士研究生.
基金项目: 国家自然科学基金攻关项目 , No. C03011402, No. C30070689 ; 军队"九、五"科技攻关项目 , No. 98D063 ; 军队回国留学人员启动基金项目 , No. 98H038 ; 军队"十、五"科技攻关青年基金项目 , No. 01Q138 ; 军队"十、五"科技攻关面上项目 , No. 01MB135 .
通讯作者: 成军, 100039, 北京市西四环中路100号, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心、全军病毒性肝炎防治研究重点实验室. cj@genetherapy.com.cn
电话: 010-66933392 传真: 010-63801283
收稿日期: 2003-11-13
修回日期: 2003-12-01
接受日期: 2003-12-16
在线出版日期: 2004-04-15
修回日期: 2003-12-01
接受日期: 2003-12-16
在线出版日期: 2004-04-15
Abstract
目的: 用酵母双杂交技术筛选肝细胞中与乙型肝炎病毒(HBV)前-X蛋白结合蛋白的编码基因.
方法: 用多聚酶链反应(PCR)法扩增HBV基因组中的前-X基因, 连接入酵母表达载体pGBKT-7中构建诱饵质粒, 转化酵母细胞AH109并在其内表达, 然后与转化了人肝细胞文库质粒的酵母细胞Y187进行配合, 在营养缺陷型培养基上进行双重筛选阳性菌落, 增菌后提出质粒, 转化入大肠杆菌(DH5), 提出质粒并测序, 进行生物信息学分析.
结果: 成功克隆出HBV的前-X基因, 构建表达载体并在酵母细胞中表达, 配合后选出在四重缺陷(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基及铺有X--半乳糖(X--gal)的四重缺陷培养基上均能生长并变成蓝色的真阳性菌落19个, 其中5个是人铁蛋白; 1个是人的胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGFBP3); 1个是人醛缩酶B; 1个是人糖基化磷脂酰肌醇锚定结合因子1(GPAA1); 1个是人血红素结合蛋白; 1个是人C1酯酶抑制子(C1-INH); 1个是人玻连蛋白; 1个是人电压依赖性阴离子通道1 (VDAC1); 1个是丝氨酸穿膜蛋白酶(hepsin); 1个是人梭素; 1个是人纤溶酶原(PLG); 3个是人假想蛋白; 1个是RP11-542M13克隆,位于染色体16.
结论: 成功克隆出前-X的结合蛋白, 为进一步研究HBV的前-X蛋白的作用提供了新线索.
Keywords: N/A