研究快报
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世界华人消化杂志. 2004-10-15; 12(10): 2463-2466
Published online 2004-10-15. doi: 10.11569/wcjd.v12.i10.2463
应用抑制性消减杂交技术筛选rhALR调节基因
刘蔚, 成军, 张连峰, 纪冬, 刘妍, 郭江, 张黎颖
刘蔚, 成军, 张连峰, 纪冬, 刘妍, 郭江, 张黎颖, 中国人民解放军302医院传染病研究所基因治疗研究中心 北京市 100039
基金项目: 国家自然科学基金攻关项目, No. C03011402, No.C30070689; 军队九五科技攻关项目, No.98D063; 军队回国留学人员启动基金项目, No.98H038; 军队十五科技攻关青年基金项目, No.01Q138; 军队十五科技攻关面上项目, No.01MB135.
通讯作者: 成军, 100039, 北京市, 中国人民解放军302医院传染病研究所基因治疗研究中心. cj@genetherapy.com.cn
电话: 010-66933392 传真:010-63801283
收稿日期: 2004-03-26
修回日期: 2004-06-09
接受日期: 2004-08-28
在线出版日期: 2004-10-15
Abstract

目的: 筛选与克隆重组人肝再生增强因子激活基因, 了解其在体内的调节功能线索及机制.

方法: 应用大肠杆菌系统, 表达、纯化重组人肝再生增强因子蛋白. 刺激HepG2细胞, 以溶剂PH7.8的磷酸盐缓冲液为平行对照, 制备转染后的细胞裂解液, 提取mRNA并逆转录为cDNA, 经Rsa I酶切后, 将实验组cDNA分成两组, 分别与两种不同的接头衔接, 再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应(PCR), 将产物与T/A载体连接, 构建cDNA消减文库, 并转染大肠杆菌进行文库扩增, 随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.

结果: 成功构建重组人肝再生增强因子激活基因差异表达的cDNA消减文库.文库扩增后得到30个阳性克隆, 进行菌落PCR分析, 均得到200-1000 bp插入片段.对插入片段测序, 并通过生物信息学分析获得其全长基因序列, 结果共获得19种编码基因, 包括15种已知基因和4种未知基因.

结论: 筛选到的cDNA全长序列, 包括一些与细胞生长调节、肿瘤免疫发生及物质代谢密切相关的蛋白编码基因, 推测了重组人肝再生增强因子在体内可能存在的调控机制的线索, 尚需进一步的实验证明.

Keywords: N/A