病毒性肝炎
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世界华人消化杂志. 2003-08-15; 11(8): 1131-1134
Published online 2003-08-15. doi: 10.11569/wcjd.v11.i8.1131
羧肽酶N调节乙型肝炎病毒核心启动子表达活性的研究
张忠东, 成军, 钟彦伟, 杨倩, 王业东, 董菁, 杨艳杰, 张树林
张忠东, 成军, 钟彦伟, 杨倩, 王业东, 董菁, 杨艳杰, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心、全军病毒性肝炎防治研究重点实验室 北京市 100039
张忠东, 男, 34岁, 汉族, 主治医师, 西安交通大学第一医院传染科2000年级内科传染病学硕士学位研究生, 主要研究乙型肝炎病毒的基因表达调控.
张树林, 西安交通大学第一医院传染科 陕西省西安市 710061
基金项目: 国家自然科学基金攻关项目, No. C03011402, No. C30070689, 军队"九、五"科技攻关项目, No. 98D063, 军队回国留学人员启动基金项目, No.98H038, 军队"十、五"科技攻关青年基金项目, No. 01Q138, 军队"十、五"科技攻关面上项目, No. 01MB135.
通讯作者: 成军, 100039, 北京市西四环中路100号, 中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心、全军病毒性肝炎防治研究重点实验室. cj@genetherapy.com.cn
电话: 010-66933391 传真: 010-63801283
收稿日期: 2003-03-08
修回日期: 2003-03-20
接受日期: 2003-04-16
在线出版日期: 2003-08-15
Abstract
目的

乙型肝炎病毒(HBV)的感染, 不仅引起急、慢性病毒性肝炎, 而且与肝纤维化、肝细胞癌的发生发展密切相关. 为深入研究HBV调节表达的机制, 我们应用噬菌体展示技术, 以HBV核心启动子DNA片段为固相支持物, 筛选肝细胞cDNA文库, 获得HBV核心启动子的肝细胞结合蛋白-羧肽酶N(CPN). CPN是一种从多肽和蛋白质C-端氨基酸残基分离的血浆金属蛋白酶, 他在调节激肽和过敏毒素的生物活性上起关键作用. CPN是分子量280 kD的四聚体, 包含两个50 KD酶性亚单位和两个83 kD调节亚单位. HBV核心启动子产生两个3.5 kb RNA: 前-核心和前基因组RNA. 前-核心RNA编码前-核心蛋白和e抗原, 前基因组RNA不仅作为mRNA编码核心蛋白和聚合酶蛋白, 而且与病毒蛋白一起包埋入核衣壳, 作为模板逆转录. 前基因组RNA的表达调控在病毒复制周期中起着关键作用. 核心启动子分为两部分: 基本核心启动子和核心上游调节元件(CURS), 其上游为负性调节元件(NER, 1616-1621 nt). CPD在体内与HBV核心启动子结合的作用还不清楚, 我们分别构建HBV核心启动子及羧肽酶N的重组载体, 通过脂质体转染NIH 3T3细胞, 研究CPN对核心启动子的调节表达.

方法

根据HBV核心启动子及羧肽酶N的序列设计引物, 在核心启动子的引物两端引入Mlu I和Nhe I的酶切位点, 在羧肽酶N的引物两端引入EcoR I和BamH I的酶切位点. 用聚合酶链反应(PCR)的方法分别扩增HBV核心启动子和羧肽酶N基因, 克隆到pGEM-Teasy载体上. 核心启动子经Mlu I和Nhe I双酶切回收连接到同样酶切的pCAT载体上, 羧肽酶N经EcoR I和BamH I双酶切回收连接到同样酶切的pcDNA3.1(-)质粒上, 构建HBV核心启动子的报告载体及羧肽酶N的真核表达载体, 脂质体法瞬时转染NIH 3T3细胞.

结果

HBV核心启动子和羧肽酶N(CPN)的PCR产物经1%琼脂糖电泳鉴定与预期大小符合, 分别为206 bp和580 bp. 重组载体经双酶切鉴定后, 证明HBV核心启动子的报告载体及羧肽酶N (CPN)的真核表达载体构建成功. 脂质体法瞬时转染NIH 3T3细胞48 h后, 用ELISA法检测β-gal的表达, 显示核心启动子在羧肽酶N(CPN)的影响下, 其活性有大约5-6倍的增加. 通过体内实验证明羧肽酶N(CPN)可以上调HBV核心启动子的表达.

结论

HBV核心启动子结合蛋白羧肽酶N (CPN)与HBV核心启动子共转染细胞, 明显调节HBV核心启动子的表达, 为进一步研究HBV复制的分子生物学机制提供了新的理论基础.

Keywords: N/A