中医药调节肠道微生态研究技术进展

表1 肠道微生态研究技术

研究技术		技术原理	优点	缺点	技术要点
微生物培养技术		在一定培养条件下, 选择适合菌种生长的培养基进行培养, 通过倍比稀释和培养来测定菌的数量和分离微生物[6]	显示不同细菌对宿主肠道系统中各种营养物质的利用情况	(1)可培养的微生物菌株数量较少; (2)严格厌氧菌培养要求高; (3)过程复杂, 难以精确鉴定; (4)分辨水平低, 不能充分反映微生物群落的多样性	(1)根据菌种特性选择培养基; (2)严格控制培养条件; (3)把控稀释过程的稀释比例
基于核酸分析的技术	变性/温度梯度凝胶电泳技术	碱基序列存在差异的不同等长 DNA 通过递增的化学变性剂浓度/温度梯度把长度相近碱基组成不同的DNA片段区分开, 根据凝胶上形成条带的数目和丰度信息反应微生物的多样性[7]	(1)分辨度高, 检测可达到一个碱基; (2)可以保证电泳的重现性以及结果的重复性; (3)快速对大量混合标本进行分析; (4)无须对引物标记; (5)节约样品; (6)在揭示微生物群落遗传多样性和种群差异方面具有明显优越性	(1)只对优势种群进行分析; (2)受到电泳条件诸多因素的影响, 出现 "共迁移"现象; (3)对微生物鉴定, 仅限于基因数据库中菌种	(1)选择最佳变性梯度/温度梯度范围; (2)确定电泳时间及温度; (3)严格"GC夹板"操作步骤; (4)染色方法的选择体现灵敏度
	末端限制性片段长度的多态性技术	利用琼脂或聚丙烯酸凝胶对限制性酶切片断电泳分离, 经染色后不同长度的DNA片段停留在不同的凝胶位置上, 呈现多态性的电泳图谱[8]	(1)结果数据化, 重复性好; (2)对微生物种类可以定性定量分析; (3)能检测到群落中比例为1%的细菌; (4)灵敏度高, 能检测活菌和未降解死菌, 是一种高效微生物群落结构 分析方法; (5)适合对微生物多样性进行灵敏的分析评价	(1)只能检测带荧光标记的末端限制性片段; (2)所需DNA数据量大分析较困难; (3)酶切后TRF长度分布会造成对复杂群落多样性的低估	(1)考虑引物的特异性(如上下游引物序列的特异性、上下游引物之间序列长度等); (2)避免选择酶切位点在序列保守区限制性内切酶
	扩增核糖体DNA限制性酶切片段分析技术	依据原核生物rDNA序列的保守性, 将扩增的rDNA片段进行酶切, 通过酶切图谱来分析菌间的多样性[9]	(1)特异性强, 效率高; (2)不受宿主干扰	(1)对于大样本的检测分析费时费力; (2)对图谱进行定量化分析困难	严格把握引物设计、扩增过程以及酶切位点
	基因芯片技术	将大量DNA探针有序地固定在载体表面, 形成储存大量信息的DNA微阵列与标记的核酸样品杂交后获取样品核酸序列信息[10]	(1)快速对成百上千基因进行分析; (2)高通量、自动化; (3)所需样品量少、成本低	(1)探针的合成和固定较为复杂, 特别针对于高密度的探针阵列; (2)探针杂交存在一定的错配率; (3)信号的获取和分析时, 灵敏度较低, 分析范围窄	(1)考虑探针的设计及布局, 确定芯片所需的检测对象; (2)杂交之前需进行分离、扩增和标记杂交反应; (3)确定杂交信号在芯片上的位置
	荧光原位杂交技术	荧光标记已知序列的单链核酸作为探针, 与待检测样本中互补的单链核酸特异性结合, 通过荧光显微镜观察带有杂交荧光标记探针细胞, 计算杂交率来定量检测和鉴定细菌[11]	(1)探针稳定, 一次标记后两年之内可以使用; (2)特异性好, 实验周期短; (3)特异性显示检测目标与组织细胞的结构关系	(1)无法对序列未知的微生物检测; (2)操作时很容易受到各种污染的干扰; (3)样品自身产生的荧光, 以及探针的特异性等因素, 容易产生假阳性实验结果. (4)探针设计不合理、细菌细胞中rRNA含量、荧光褪色等因素, 容易产生假阴性的实验结果	(1)考虑多种探针的利弊; (2)杂交前的需要对细胞通透性、杂交背景等进行处理; (3)杂交过程中环境保持黑暗、潮湿, 控制杂交时间、温度以及探针浓度和长度
	实时荧光PCR技术	利用荧光信号变化实时检测PCR扩增反应中每个循环扩增产物量的变化, 通过Ct值和标准曲线实现对起始模板的定量分析[12]	(1)直接监测扩增中荧光信号变化获得定量结果, 精确性和灵敏度高; (2)检测速度快, 可同时进行几个反应; (3)特异性、重复性强	(1)引物二聚体、 单链二级结构及扩增产物错误, 会出现假阳性结果; (2)荧光素种类及检测光源的局限性会限制 RT-PCR的复合式检测应用能力; (3)无法得到整个微生物群落的信息	(1)设计合适引物, 防止非特异性扩增; (2)设计合适的探针温度、浓度等, 保证探针的灵敏度和特异性; (3)PCR体系反应参数的设定
	高通量检测技术	当引物与模板DNA 复性后, 在酶的协同作用下, dNTP 聚合与荧光信号的释放偶联, 以荧光信号的形式实时记录模板 DNA 的核苷酸序列[13]	(1)测序片段短、无需构建基因文库; (2)高输出量和高解析度; (3)同时对样品中的优势物种、稀有物种及一些未知的物种检测;	(1)设备昂贵、测序成本高; (2)大数据量的DNA样本, 缺乏匹配的参考数据库, 许多数据无法进行功能注释; (3)无法确定样品中特定微生物的具体数量	选择适合的测序平台和可变区
基于蛋白质的分析	蛋白质组学技术	基于质谱技术, 对完整的细胞、组织、体液等样品的全部蛋白质进行定性, 定量的分析[14]	在整体水平上对基因组表达的全部蛋白质进行大规模研究, 直接说明肠道菌群的功能	(1)对于一些低丰度蛋白质的检测能力有限; (2)容易受到饮食等其他因素干扰	(1)尽可能完整地将所有蛋白质从细胞或者组织中提取; (2)蛋白质组样品的分离方法的选择
基于代谢产物的分析	色谱技术	利用带分离的各种物质在两相中(固体相、流动相)的分配系数、吸附能力等亲和力的不同进行分离[15]	(1)具有高分离能力的色谱技术能够提高检测效率, 准确获得样品中目标化合物的相关信息; (2)分析灵敏度高, 重复性好	(1)样品前处理技术复杂, 容易影响实验结果; (2)检测条件受检测器制约, 存在局限	(1)色谱条件的设定(包括色谱柱、柱温、检测波长等); (2)检测器的选择
肠道酶活性检测技术		将酶液与底物混合, 通过水浴、终止反应、定容等步骤, 最后利用紫外分光光度计在特定波长下测定吸光度[16]	(1)快速简便; (2)样本用量较少	(1)检测通过对代谢产物进行间接地证明酶的活性高低, 可靠性受到影响; (2)侵入性手段影响实验的准确性	(1)酶液、底物的配置; (2)水浴温度、时间; (3)显色温度、时间; (4)波长的设定
肠道微生物活度检测技术		利用荧光素二乙酸与磷酸缓冲液混合, 加入待测样液充分混合后, 丙酮终止反应, 利用紫外分光光度计测定吸光度[17]	(1)快速简便; (2)灵敏度高	(1)丙酮加入终止反应后, 放置时间过长, 影响实验结果; (2)实验过程中稀释和定容不准确, 对于实验结果影响较大	(1)FDA反应液制备; (2)丙酮加入的先后顺序; (3)把握实验过程中的稀释和定容
体外模拟胃肠道环境		活化的菌种按比例接种至人工胃液和人工肠液中培养一段时间后进行活菌计数[18]	(1)操作简单快速; (2)不受伦理限制; (3)较直观的看到实验结果	(1)选择接种液与接种方式的不同, 对结果呈现很大的影响; (2)与人体胃肠道的真实情况尚存在差异	(1)菌种接种至已灭菌的斜面培养基上进行活化; (2)人工胃肠液的浓度配比