LncRNA GAS5-AS1靶向miR-106a-5p调控结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭

摘要

背景

长链非编码RNA(long non-coding RNA, LncRNA)生长停滞特异性转录本5反义RNA(growth arrest specific transcript 5 antisense RNA, GAS5-AS1)被发现在多种癌症中扮演肿瘤抑制因子的作用. 但是其在结直肠癌(colorectal cancer, CRC)进展中的作用和机制尚不清楚.

目的

探讨LncRNA GAS5-AS1靶向miR-106a-5p在CRC进展中的作用.

方法

实时荧光定量聚合酶链反应分析LncRNA GAS5-AS1和miR-106a-5p在43对CRC组织和癌旁组织样本中的表达. 分别转染pcDNA、pcDNA-LncRNA GAS5-AS1、anti-miR-NC、anti-miR-106a-5p、si-NC、si-LncRNA GAS5-AS1、pcDNA-LncRNA GAS5-AS1+miR-NC、pcDNA-LncRNA GAS5-AS1+miR-106a-5p mimics至HCT8细胞. 细胞计数试剂盒-8法检测细胞活力; Transwell小室法检测迁移和侵袭细胞数. 通过双荧光素酶报告实验确定LncRNA GAS5-AS1和miR-106a-5p的靶向关系.

结果

与癌旁组织比较, CRC组织中LncRNA GAS5-AS1表达降低(P<0.05), miR-106a-5p表达升高(P<0.05). 与转染pcDNA比较, 转染pcDNA-LncRNA GAS5-AS1后HCT8细胞活力、迁移、侵袭、miR-106a-5p表达显著降低(P<0.05). 与转染anti-miR-NC比较, 转染anti-miR-106a-5p后HCT8细胞活力、迁移和侵袭细胞数显著降低(P<0.05). 与转染si-NC比较, 转染si-LncRNA GAS5-AS1后miR-106a-5p表达水平显著升高(P<0.05). 与转染miR-NC比较, 转染miR-106a-5p能显著降低LncRNA GAS5-AS1-WT载体的荧光素酶活性, 表明miR-106a-5p是LncRNA GAS5-AS1的直接靶点. 与转染pcDNA-LncRNA GAS5-AS1+miR-NC比较, 转染pcDNA-LncRNA GAS5-AS1+miR-106a-5p mimics后HCT8细胞活力、迁移和侵袭细胞数显著升高(P<0.05).

结论

LncRNA GAS5-AS1通过靶向miR-106a-5p来抑制CRC细胞增殖、迁移和侵袭.

关键词: 结直肠癌; LncRNA GAS5-AS1; miR-106a-5p; 细胞增殖; 迁移; 侵袭

核心提要: 本研究揭示长链非编码RNA生长停滞特异性转录本5反义RNA(growth arrest specific transcript 5 antisense RNA, GAS5-AS1)通过靶向miR-106a-5p来抑制结直肠癌(colorectal cancer, CRC)细胞增殖、迁移和侵袭, 表明GAS5-AS1可能是CRC治疗的潜在分子靶点.

LncRNA GAS5-AS1 regulates colorectal cancer cell proliferation, migration, and invasion by targeting miR-106a-5p

Zhou Yu, Man-Yi Hu, Jian Dai

Zhou Yu, Man-Yi Hu, Jian Dai, Department of Colorectal and Anal Surgery, Jinhua Central Hospital, Jinhua 321000, Zhejiang Province, China

Supported by: Jinhua City Science and Technology Plan Project, No. 2023-4-068.

Corresponding author: Zhou Yu, Graduate Student, Attending Physician, Department of Colorectal and Anal Surgery, Jinhua Central Hospital, No. 365 East Renmin Road, Wucheng District, Jinhua 321000, Zhejiang Province, China. yuzhou.2008@163.com

Received: April 30, 2024
Revised: June 12, 2024
Accepted: June 26, 2024
Published online: July 28, 2024

Abstract

BACKGROUND

The long non-coding RNA (lncRNA) growth arrest specific transcript 5 antisense RNA (GAS5-AS1) has been found to act as a tumor suppressor in a variety of cancers. However, its role and mechanism in colorectal cancer (CRC) progression remain unclear.

AIM

To investigate the role of the lncRNA GAS5-AS1 targeting miR-106a-5p in the progression of CRC.

METHODS

GAS5-AS1 and miR-106a-5p expression levels in 43 pairs of CRC tissues and adjacent tissue samples were determined by real-time quantitative PCR. After pcDNA, pcDNA-GAS5-AS1, anti-miR-NC, anti-miR-106a-5p, si-NC, si-GAS5-AS1, pcDNA-GAS5-AS1 + miR-NC, and pcDNA-GAS5-AS1 + miR-106a-5p mimic were transfected into HCT8 cells, cell counting kit-8 method was used to detect cell viability, and transwell assays were used to detect the number of migrating and invading cells. The target relationship between GAS5-AS1 and miR-106a-5p was determined by dual-luciferase reporter assay.

RESULTS

Compared with adjacent normal tissues, GAS5-AS1 expression in CRC tissue was decreased (P < 0.05), and miR-106a-5p expression was increased (P < 0.05). Compared with cells transfected with pcDNA, cell viability, migration, and invasion and miR-106a-5p expression in HCT8 cells were significantly reduced after transfection of with pcDNA-GAS5-AS1 (P < 0.05). Compared with cells transfected with anti-miR-NC, cell viability, migration, and invasion in HCT8 transfected with anti-miR-106a-5p were significantly reduced (P < 0.05). Compared with cells transfected with si-NC, the expression level of miR-106a-5p was significantly increased in cells transfected with si-GAS5-AS1 (P < 0.05). Compared with cells transfected with miR-NC, transfection of miR-106a-5p significantly reduced the luciferase activity of the GAS5-AS1-WT vector, indicating that miR-106a-5p is the direct target of GAS5-AS1. Compared with cells transfected with pcDNA-GAS5-AS1 + miR-NC, cell viability, migration, and invasion were significantly increased in cells transfected with pcDNA-GAS5-AS1 + miR-106a-5p mimic (P < 0.05).

CONCLUSION

GAS5-AS1 inhibits CRC cell proliferation, migration, and invasion by targeting miR-106a-5p.

Key Words: Colorectal cancer; LncRNA GAS5-AS1; miR-106a-5p; Cell proliferation; Migration; Invasion

0 引言

结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是全球最常见的癌症之一, 虽然目前已有手术、放化疗等治疗策略, 但多数患者在接受一系列治疗后仍存在较大复发风险[1]. 因此, 进一步了解CRC的分子机制, 识别潜在的生物标志物对开发新型治疗方法至关重要. 长链非编码RNA(long non-coding RNA, LncRNA)是基因表达的主要调节因子, 其通过与微小RNA(microRNA, miRNA)和蛋白编码mRNA相互作用, 影响增殖、转移、血管生成、自噬、凋亡、放化疗抵抗等肿瘤生物学过程, 是肿瘤治疗的候选靶标[2,3]. 研究报道LncRNA生长停滞特异性转录本5反义RNA(growth arrest specific transcript 5 antisense RNA, GAS5-AS1)表达降低与肝癌低分化、TNM分期增高、预后差显著相关[4]. 非小细胞肺癌中LncRNA GAS5-AS1表达下调, LncRNA GAS5-AS1异位表达可抑制肿瘤转移[5]. 然而, LncRNA GAS5-AS1在CRC中的功能未见报道. miR-106a-5p是前列腺癌、肺癌的致癌因子, miR-106a-5p高表达有助于前列腺癌肿瘤形成, 并促进肺癌转移[6,7]. 在CRC中miR-106a-5p介导肿瘤转移和5-氟尿嘧啶耐药[8]. 生物信息学预测显示miR-106a-5p是LncRNA GAS5-AS1的潜在靶点, 但LncRNA GAS5-AS1是否靶向miR-106a-5p调控CRC进展仍需研究. 本研究分析了CRC中LncRNA GAS5-AS1、miR-106a-5p表达情况, 并通过功能获得或缺失实验分析其在CRC进展中功能.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 组织: 以2021-03/2023-10在我院接受手术治疗43例(男27例, 女16例, 年龄45岁-76岁, 平均年龄65岁±6.85岁)CRC患者的CRC组织和癌旁组织对研究对象. 纳入标准: 经病理检查诊断为CRC; 术前未进行治疗; 排除标准: 患有其他疾病者; 入院前接受抗肿瘤治疗者. 所有患者均签署书面知情同意书, 本研究经本医院伦理委员会批准.

1.1.2 细胞和试剂: 人正常结直肠上皮细胞NCM460以及CRC细胞(HCT8、Caco-2、DLD-1)购自中国科学院生化与细胞所; QuantiTect逆转录试剂盒、MiScript II逆转录试剂盒购自北京金泰宏达科技公司; SYBR Green荧光定量染料法试剂盒购自美国ABI公司; 野生型(wild-type, WT)LncRNA GAS5-AS1荧光素酶报告质粒(LncRNA GAS5-AS1-WT)、突变型(mutant-type, MUT)LncRNA GAS5-AS1荧光素酶报告质粒(LncRNA GAS5-AS1-MUT)、pcDNA、pcDNA-LncRNA GAS5-AS1购自上海生工公司; si-NC、si-LncRNA GAS5-AS1、anti-miR-NC、anti-miR-106a-5p、miR-106a-5p mimics、miR-NC购自南京金斯瑞生物公司; 细胞周期蛋白D1(CyclinD1)兔多克隆抗体(ab226977)、基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2, MMP2)兔多克隆抗体(ab97779)、β-肌动蛋白(β-actin)兔多克隆抗体(ab8227)、基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9, MMP9)兔多克隆抗体(ab73734)购自美国Abcam公司; 细胞计数试剂盒(cell counting kit-8, CCK-8)购自大连美仑生物公司; TRIzol试剂购自上海联迈生物公司; Transwell小室购自美国BD公司.

1.2 方法

1.2.1 细胞培养: NCM460、HCT8、DLD-1细胞采用RPMI-1640培养基培养, Caco-2细胞采用MEM培养基置于37 ℃、80%湿度、含5%CO₂温箱孵育. 培养基中均添加10%胎牛血清和1%青-链霉素双抗. 胰酶消化80%融合细胞1:4传代.

1.2.2 实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative PCR, RT-qPCR)检测LncRNA GAS5-AS1、miR-106a-5p表达: TRIzol法提取组织样本和细胞中的总RNA, QuantiTect逆转录试剂盒、MiScript II逆转录试剂盒分别合成circRNA、miRNA的cDNA, 再用SYBR Green法进行RT-qPCR. 用2^-ΔΔCt方法定量基因表达水平.

1.2.3 转染和实验分组: 对数生长期HCT8细胞按2×10⁴个/孔接种24孔板, 用Lipofectamine 2000将质粒或寡核苷酸转染HCT8细胞. 收集转染48 h细胞, RT-qPCR法检测LncRNA GAS5-AS1或miR-106a-5p表达. 未转染HCT8细胞记为对照(NC)组. 其他根据转染物不同分为pcDNA组、pcDNA-LncRNA GAS5-AS1组、si-NC组、si-LncRNA GAS5-AS1组、anti-miR-106a-5p组、anti-miR-NC组、pcDNA-LncRNA GAS5-AS1+miR-NC组、pcDNA-LncRNA GAS5-AS1 +miR-106a-5p组.

1.2.4 CCK-8法检测细胞活力: 将转染的HCT8细胞以5×10³个/孔接种于96孔板, 培养过夜后检测细胞活力. 在每孔中加入10 μL CCK-8溶液, 孵育2 h后, 在450 nm处用酶标仪测定吸光度值(A值), 评估细胞活力.

1.2.5 Transwell法检测细胞迁移和侵袭: 迁移测定: 转染的HCT8细胞重新悬浮在无血清培养基中, 取200 μL(含1×10⁵个转染细胞)细胞悬液加入上室, 将600 μL含血清培养基加入到下室. 培养24 h后, 用甲醇固定下室细胞, 结晶紫染色. 每组随机选择5个计数染色细胞数, 取均值表示迁移数. 侵袭测定: 将适量体积Matrigel和8倍体积无血清培养基混合, 取500稀释液包被Transwell上室, 室温凝固后备用, 其他步骤和迁移测定相同.

1.2.6 Western blot检测CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表达: RIPA裂解液用于提取细胞总蛋白, 100 V的SDS-PAGE电泳110 min分离蛋白, 400 mA电流转膜30 min. 洗膜缓冲液漂洗2 min, 5%脱脂牛奶封闭膜后, 立即加入CyclinD1、MMP2和MMP9一抗稀释液, 室温孵育1 h. 洗膜缓冲液漂洗10 min, 立即加入二抗稀释液室温孵育1 h. 用化学发光试剂检测蛋白, Image J软件分析目的条带的相对灰度值.

1.2.7 双荧光素酶报告实验: 利用LncBase Predicted v.2网站预测LncRNA GAS5-AS1和miR-106a-5p之间的结合位点. 将报告质粒LncRNA GAS5-AS1-MUT、LncRNA GAS5-AS1-WT分别与miR-NC或miR-106a-5p mimics共转染HCT8细胞. 48 h后测定萤火虫和海肾荧光素酶活性值, 计算相对荧光素酶活性.

统计学处理 每次检测时设置3个复孔, 实验独立重复进行3次, 数据以平均数±标准差(mean±SD)表示. 采用SPSS 20.0进行统计分析. 独立样本t检验用于评估两组数据差异, 单因素方差分析和SNK-q检验用于分析多组数据差异. ^aP<0.05或^bP<0.05为差异有统计学意义.

2 结果

2.1 结直肠癌组织中LncRNA GAS5-AS1和miR-106a-5p表达情况

结直肠癌组织中LncRNA GAS5-AS1水平显著低于癌旁组织(P<0.05), 而miR-106a-5p水平显著高于癌旁组织(P<0.05), 见图1.

图1 LncRNA GAS5-AS1和miR-106a-5p在结直肠癌组织和癌旁组织中的表达. CRC: 结直肠癌; lncRNA: 长链非编码RNA; GAS5-AS1: 生长停滞特异性转录本5反义RNA. ^aP<0.05, 与正常组织组比较.

2.2 结直肠癌细胞系中LncRNA GAS5-AS1和miR-106a-5p表达情况

与人正常结直肠上皮细胞NCM460比较, 结直肠癌细胞系HCT8、Caco-2、DLD-1中LncRNA GAS5-AS1表达水平显著降低(P<0.05), miR-106a-5p表达水平显著升高(P<0.05), 见图2. 选择表达差异较大的HCT8细胞进行功能实验.

图2 LncRNA GAS5-AS1和miR-106a-5p在结直肠癌细胞和NCM460细胞中的表达. lncRNA: 长链非编码RNA; GAS5-AS1: 生长停滞特异性转录本5反义RNA. ^aP<0.05, 与NCM460组比较.

2.3 上调LncRNA GAS5-AS1抑制结直肠癌细胞HCT8增殖、迁移和侵袭

与pcDNA组比较, pcDNA-LncRNA GAS5-AS1组HCT8细胞LncRNA GAS5-AS1表达量显著升高(P<0.05), A值、CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表达、细胞迁移和侵袭数量显著减少(P<0.05), 见图3和表1.

表1 上调LncRNA GAS5-AS1影响CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表达(mean±SD, n = 9).

组别	LncRNA GAS5-AS1	CyclinD1	MMP2	MMP9
NC	1.00±0.10	0.95±0.09	0.83±0.07	0.78±0.07
pcDNA	1.00±0.11	0.96±0.08	0.85±0.08	0.77±0.06
pcDNA-LncRNA GAS5-AS1	2.45±0.04a	0.48±0.05a	0.41±0.04a	0.35±0.03a
F	798.418	119.488	129.209	173.011
P	0.000	0.000	0.000	0.000

^aP<0.05, 与pcDNA组比较. lncRNA: 长链非编码RNA; GAS5-AS1: 生长停滞特异性转录本5反义RNA; MMP2: 金属基质蛋白酶2; MMP9: 金属基质蛋白酶9, NC: 正常对照.

图3 上调LncRNA GAS5-AS1对HCT8细胞增殖、迁移和侵袭的影响. A: Western Blot检测CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表达; B: CCK-8检测细胞活力; C: Transwell分析迁移和侵袭细胞数. lncRNA: 长链非编码RNA; GAS5-AS1: 生长停滞特异性转录本5反义RNA; MMP2: 金属基质蛋白酶2; MMP9: 金属基质蛋白酶9; NC: 正常对照. ^aP<0.05, 与pcDNA组比较.

2.4 下调anti-miR-106a-5p抑制结直肠癌细胞HCT8增殖、迁移和侵袭

与anti-miR-NC组比较, miR-106a-5p组HCT8细胞miR-106a-5p表达量、A值、CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表达、细胞迁移和侵袭数量显著减少(P<0.05), 见图4和表2.

表2 下调miR-106a-5p影响CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表达(mean±SD, n = 9).

组别	miR-106a-5p	CyclinD1	MMP2	MMP9
anti-miR-NC	1.00±0.10	0.95±0.07	0.87±0.09	0.76±0.06
anti-miR-106a-5p	0.42±0.04a	0.43±0.05a	0.48±0.03a	0.37±0.03a
t	16.155	18.135	12.333	17.441
P	0.000	0.000	0.000	0.000

^aP<0.05, 与anti-miR-NC组比较. MMP2: 金属基质蛋白酶2; MMP9: 金属基质蛋白酶9.

图4 下调miR-106a-5p对HCT8细胞增殖、迁移和侵袭的影响. A: Western Blot检测CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表达; B: CCK-8检测细胞活力; C: Transwell分析迁移和侵袭细胞数. MMP2: 金属基质蛋白酶2; MMP9: 金属基质蛋白酶9. ^aP<0.05, 与anti-miR-NC组比较.

2.5 LncRNA GAS5-AS1靶向调控miR-106a-5p表达

LncBase Predicted v.2预测到LncRNA GAS5-AS1与miR-106a-5p存在结合位点, 见图5. 与转染miR-NC比较, 转染miR-106a-5p可以显著降低LncRNA GAS5-AS1-WT细胞相对荧光素酶活性(P<0.05), 见表3. pcDNA-LncRNA GAS5-AS1组HCT8细胞LncRNA GAS5-AS1表达量显著高于pcDNA组(P<0.05), miR-106a-5p表达量显著低于pcDNA组(P<0.05); si-LncRNA GAS5-AS1组HCT8细胞LncRNA GAS5-AS1表达量显著低于si-NC组(P<0.05), miR-106a-5p表达量显著高于si-NC组(P<0.05), 见表4.

表3 相对荧光素酶活性检测(mean±SD, n = 9).

组别	相对荧光素酶活性
	LncRNA GAS5-AS1-WT	LncRNA GAS5-AS1-MUT
miR-NC	1.00±0.10	1.00±0.11
miR-106a-5p	0.41±0.04a	0.97±0.07
t	16.434	0.690
P	0.000	0.500

^aP<0.05, 与miR-NC组比较. lncRNA: 长链非编码RNA; GAS5-AS1: 生长停滞特异性转录本5反义RNA; WT: 野生型; MUT: 突变型.

表4 RT-qPCR检测miR-106a-5p的表达(mean±SD, n = 9).

组别	LncRNA GAS5-AS1	miR-106a-5p
pcDNA	1.00±0.11	1.00±0.09
pcDNA-LncRNA GAS5-AS1	2.35±0.18a	0.45±0.04a
si-NC	1.02±0.09	0.98±0.08
si-LncRNA GAS5-AS1	0.46±0.04b	2.34±0.21b
F	430.024	388.759
P	0.000	0.000

^aP<0.05, 与pcDNA组比较;

^bP<0.05, 与si-NC组比较. lncRNA: 长链非编码RNA; GAS5-AS1: 生长停滞特异性转录本5反义RNA.

图5 miR-106a-5p和LncRNA GAS5-AS1结合预测示意图. lncRNA: 长链非编码RNA; GAS5-AS1: 生长停滞特异性转录本5反义RNA.

2.6 过表达miR-106a-5p能够逆转上调LncRNA GAS5-AS1对HCT8细胞增殖、迁移和侵袭的影响

与pcDNA-LncRNA GAS5-AS1+miR-NC组比较, pcDNA-LncRNA GAS5-AS1+ miR-106a-5p组HCT8细胞miR-106a-5p表达量、A值、CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表达、细胞迁移和侵袭数量显著上调(P<0.05), 见图6和表5.

表5 过表达miR-106a-5p能够逆转上调LncRNA GAS5-AS1对CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表达的影响(mean±SD, n = 9).

组别	miR-106a-5p	CyclinD1	MMP2	MMP9
pcDNA	1.00±0.08	0.95±0.08	0.88±0.08	0.80±0.07
pcDNA-LncRNA GAS5-AS1	0.44±0.05a	0.45±0.04a	0.40±0.05a	0.32±0.03a
pcDNA-LncRNA GAS5-AS1+miR-NC	1.00±0.09	0.46±0.04	0.40±0.04	0.36±0.02
pcDNA-LncRNA GAS5-AS1+miR-106a-5p	1.98±0.16b	0.87±0.07b	0.82±0.08b	0.73±0.07b
t	16.015	15.256	14.087	15.247
P	0.000	0.000	0.000	0.000

^aP<0.05, 与pcDNA组比较;

^bP<0.05, 与pcDNA-LncRNA GAS5-AS1+miR-NC组比较. lncRNA: 长链非编码RNA; GAS5-AS1: 生长停滞特异性转录本5反义RNA; MMP2: 金属基质蛋白酶2; MMP9: 金属基质蛋白酶9.

图6 过表达miR-106a-5p能够逆转上调LncRNA GAS5-AS1对HCT8细胞增殖、迁移和侵袭的影响. A: Western Blot检测CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表达; B: CCK-8检测细胞活力; C: Transwell分析迁移和侵袭细胞数. lncRNA: 长链非编码RNA; GAS5-AS1: 生长停滞特异性转录本5反义RNA; MMP2: 金属基质蛋白酶2; MMP9: 金属基质蛋白酶9. ^aP<0.05, 与pcDNA组比较; ^bP<0.05, 与pcDNA-LncRNA GAS5-AS1+miR-NC组比较.

3 讨论

LncRNA GAS5-AS1表达失调与多种肿瘤进展相关, 研究指出LncRNA GAS5-AS1在宫颈癌表达下调, 联合检测LncRNA GAS5-AS1以及其他5个LncRNA表达水平可预测宫颈癌患者的预后, 上调LncRNA GAS5-AS1表达可抑制宫颈癌的致瘤性和转移能力[9,10]. 另一项研究显示LncRNA GAS5-AS1是胃癌预后的生物标志物[11]. 此外, 有报道称[12]上调LncRNA GAS5-AS1对胶质瘤生长和转移亦具有抑制作用. 本研究检测到CRC组织、细胞中LncRNA GAS5-AS1表达下调, 提示LncRNA GAS5-AS1低表达可能促进CRC进展. 功能获得实验显示, 上调LncRNA GAS5-AS1表达显著可降低HCT8细胞的增殖、迁移和侵袭能力, 并下调促增殖蛋白CyclinD1以及促转移蛋白MMP2、MMP9的表达水平, 这与之前研究报道LncRNA GAS5-AS1的抗增殖、抗转移作用吻合, 表明LncRNA GAS5-AS1在CRC中发挥抑癌功能.

LncRNA可与特异性miRNA结合, 从而隔离miRNA并改变其下游靶基因的表达, 这种由lncRNA-miRNA-mRNA相互作用形成的竞争性内源性RNA网络广泛参与调控CRC生物学过程[13]. 例如, LINC01278通过靶向miR-134-5p、上调赖氨酸脱甲基酶2A(KDM2A)表达促进CRC细胞增殖和迁移[14]. LncRNA尿路上皮癌相关1(UCA1)调控miR-23b-3p/锌指蛋白281(ZNF281)轴介导CRC细胞5-氟尿嘧啶耐药[15]. miR-106a-5p是一种小型非编码RNA, 其在肝癌组织中表达上调, 且下调其表达能够抑制肝癌细胞侵袭转移[16]. miR-106a-5p还是LncRNA人类白细胞抗原复合体18(human leukocyte antigen complex group 18, HCG18)的下游靶点, miR-106a-5p下调介导LncRNA HCG18对乳头状甲状腺癌细胞存活、上皮-间质转化、侵袭的抑制作用[17]. 本研究检测到CRC组织、细胞中miR-106a-5p表达上调, 且下调miR-106a-5p表达可降低HCT8细胞的增殖、迁移和侵袭能力, 这与上述研究中下调miR-106a-5p表达的抗癌功能一致. 然而, 乳腺癌、肾细胞癌miR-106a-5p表达降低, miR-106a-5p在癌症进程中发挥抑癌作用, 这种差异可能与肿瘤异质性有关[18,19]. 深入分析显示, miR-106a-5p是LncRNA GAS5-AS1的直接靶点. 下调miR-106a-5p表达和上调LncRNA GAS5-AS1表达的抗肿瘤作用类似, 且miR-106a-5p表达受到LncRNA GAS5-AS1负性调控, 提示LncRNA GAS5-AS1可能通过lncRNA-miRNA网络发挥作用. 过表达miR-106a-5p显著削弱上调LncRNA GAS5-AS1对HCT8细胞行为的影响, 这表明LncRNA GAS5-AS1通过靶向miR-106a-5p参与CRC进展. 然而, 本研究尚存在不足之处. 通过生信分析, 我们发现miR-106a-5p的下游靶点有很多, 靶基因筛选流程还需要仔细规划. 因此, LncRNA GAS5-AS1/miR-106a-5p轴的具体下游靶基因还需要进一步的实验分析才能确定. 此外, 仍需要开展动物实验来验证LncRNA GAS5-AS1/miR-106a-5p轴的功能, 进一步丰富研究结果.

4 结论

综上所述, CRC中LncRNA GAS5-AS1表达降低. 上调LncRNA GAS5-AS1通过靶向miR-106a-5p抑制CRC细胞生物学行为. 这为阐明CRC进展机制提供理论基础, 并为CRC治疗提供潜在靶点.

文章亮点

实验背景

结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是常见的消化道肿瘤, 严重威胁患者生命, 因此有必要阐明影响其进展的分子机制.

实验动机

探究影响CRC进展的分子机制可能为其治疗提供潜在分子靶点.

实验目标

揭示长链非编码RNA(long non-coding RNA, LncRNA)生长停滞特异性转录本5反义RNA(growth arrest specific transcript 5 antisense RNA, GAS5-AS1)在CRC进展中的作用及潜在分子机制.

实验方法

通过转染pcDNA-LncRNA GAS5-AS1分析LncRNA GAS5-AS1对CRC细胞增殖、迁移和侵袭的影响; 通过转染anti-miR-106a-5p确定miR-106a-5p敲低对CRC细胞增殖、迁移和侵袭的影响; 双荧光素酶报告实验确定LncRNA GAS5-AS1和miR-106a-5p的靶向关系; 通过共转染pcDNA-LncRNA GAS5-AS1和miR-106a-5p mimics确定LncRNA GAS5-AS1是否通过调控miR-106a-5p介导CRC细胞增殖、迁移和侵袭.

实验结果

LncRNA GAS5-AS1过表达或miR-106a-5p敲低均可以抑制CRC细胞增殖、迁移和侵袭; LncRNA GAS5-AS1可以靶向miR-106a-5p, 且miR-106a-5p mimics可以逆转LncRNA GAS5-AS1对CRC细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用.

实验结论

上调LncRNA GAS5-AS1通过靶向miR-106a-5p抑制CRC细胞增殖、迁移和侵袭, 这可能为CRC的治疗提供潜在分子靶点.

展望前景

未来仍需要探究CRC的发病机制, 为CRC临床治疗提供新思路.

备注

学科分类: 胃肠病学和肝病学

手稿来源地: 浙江省

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科学编辑:张砚梁 制作编辑:张砚梁

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