circ_0000527和miR-1253在结直肠癌组织中的表达及其对直肠癌SW620细胞增殖、迁移及侵袭的影响

摘要

背景

circRNA在结直肠癌中表达上调/下调, 并可充当miRNA的海绵分子, 负向调控miRNA表达, 进而参与结直肠癌发生发展过程, 目前已知circ_0000527在骨肉瘤等肿瘤组织中呈高表达, circ_0000527与miR-1253存在互补序列, miR-1253在结直肠癌组织和细胞中表达下调, 但circ_0000527是否可调控miR-1253表达从而影响结直肠癌细胞生物学行为尚未可知.

目的

探讨circ_0000527靶向miR-1253调控结直肠癌SW620细胞增殖、迁移及侵袭的影响.

方法

收集2020-03/2020-08本院收治的41例结直肠癌患者的癌组织及其癌旁组织标本, qRT-PCR法检测circ_0000527、miR-1253的表达量; 将人结直肠癌细胞SW620分为si-NC组、si-circ_0000527组、miR-NC组、miR-1253组、si-circ_0000527+anti-miR-NC组、si-circ_0000527+anti-miR-1253组; CCK-8、平板克隆形成、划痕实验、Transwell实验检测增殖、克隆形成、迁移和侵袭; 双荧光素酶报告实验检测circ_0000527与miR-1253靶向.

结果

在结直肠癌组织中circ_0000527表达量升高(P＜0.05), miR-1253表达量降低(P＜0.05); 转染si-circ_0000527或转染miR-1253 mimics后, 细胞活力、划痕愈合率降低(P＜0.05), 细胞克隆形成数和侵袭细胞数减少(P＜0.05); circ_0000527可靶向结合miR-1253; 共转染si-circ_0000527、anti-miR-1253可逆转si-circ_0000527对SW620细胞生物学行为的作用.

结论

干扰circ_0000527表达可通过上调miR-1253表达而减弱结直肠癌细胞增殖、克隆形成、迁移及侵袭能力.

关键词: 结直肠癌; circ_0000527; miR-1253; 细胞增殖; 迁移; 侵袭

核心提要: circ_0000527调节结直肠癌细胞生物学行为的分子机制尚未可知, circ_0000527与miR-1253存在靶向结合位点, miR-1253在结直肠癌中表达下调,探讨circ_0000527是否通过靶向调控miR-1253表达影响结直肠癌细胞的增殖、迁移及侵袭.

Circ_0000527 regulates proliferation, migration, and invasion of colorectal cancer SW620 cells by targeting miR-1253

Ying Li, Yi Sang, Wei-Hua Wu

Ying Li, Department of Special Examination, Hangzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine Affiliated to Zhejiang Chinese Medicine University, Hangzhou 311700, Zhejiang Province, China

Yi Sang, Department of Gastroenterology, Hangzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine, Zhejiang Chinese Medicine University, Hangzhou 311700, Zhejiang Province, China

Wei-Hua Wu, Hangzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine ICU, Zhejiang Chinese Medicine University, Hangzhou 311700, Zhejiang Province, China

Corresponding author: Ying Li, Department of Special Examination, Hangzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine Affiliated to Zhejiang Chinese Medicine University, No. 453 Tiyuchang Road, Xihu District, Hangzhou 310000, Zhejiang Province, China. hzliying0806@163.com

Received: April 20, 2022
Revised: May 30, 2022
Accepted: June 21, 2022
Published online: July 28, 2022

Abstract

BACKGROUND

The expression of circular RNAs (circRNAs) may be up-regulated/down-regulated in colorectal cancer, and they act as sponge molecules of microRNAs (miRNAs), negatively regulate the expression of miRNAs, and participate in the occurrence and development of colorectal cancer. It is known that circ_0000527 is highly expressed in tumor tissues such as osteosarcoma, and circ_0000527 has a complementary sequence with miR-1253, which is down-regulated in colorectal cancer tissues and cells. However, it is unknown whether circ_0000527 can regulate the expression of miR-1253 and thus affect the biological behavior of colorectal cancer cells.

AIM

To investigate the effect of circ_0000527 targeting miR-1253 on the proliferation, migration, and invasion of colorectal cancer SW620 cells.

METHODS

Tumor and tumor-adjacent tissue samples were collected from 41 colorectal cancer patients treated at our hospital from March 2020 to August 2020, and the expression of circ_0000527 and miR-1253 was detected by qRT-PCR. Human colorectal cancer SW620 cells were divided into si-NC group, si-circ_0000527 group, miR-NC group, miR-1253 group, si-circ_0000527 + anti-miR-NC group, and si-circ_0000527 + anti-miR-1253 group. CCK-8 assay, plate clone formation assay, scratch assay, and Transwell assay were used to detect cell proliferation, clone formation, migration, and invasion, respectively. Dual luciferase reporter assay was used to detect the targeting relationship between circ_0000527 and miR-1253.

RESULTS

In colorectal cancer tissues, the expression of circ_0000527 was increased (P < 0.05), and the expression of miR-1253 was decreased (P < 0.05). After transfection of SW620 cells with si-circ_0000527 or miR-1253 mimic, cell viability and wound healing rate were decreased (P < 0.05), and the number of cell clones and invasive cells was decreased (P < 0.05). Circ_0000527 could target and bind miR-1253. Co-transfection of si-circ_0000527 and anti-miR-1253 could reverse the effect of si-circ_0000527 on the biological behavior of SW620 cells.

CONCLUSION

Interference with the expression of circ_0000527 attenuates the ability of colorectal cancer cells to proliferate, form closes, migrate, and invade by up-regulating the expression of miR-1253.

Key Words: Colorectal cancer; circ_0000527; miR-1253; Cell proliferation; migration; Invasion

0 引言

结直肠癌是我国常见的一种恶性肿瘤, 虽然结直肠癌诊断与治疗技术有所提高, 但中晚期结直肠癌患者预后较差, 因而仍需探究结直肠癌发生及发展的分子机制[1,2]. 环状RNA(circular RNA, circRNA)在结直肠癌中表达异常, 并可发挥重要调控作用[3,4]. circ_0000527在骨肉瘤组织中高表达, 上调其表达可促进骨肉瘤细胞的增殖[5]. Circular RNA Interactome预测显示circ_0000527与miR-1253存在互补序列. 研究表明[6], miR-1253在结直肠癌组织和细胞中表达下调, 抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭. 因此, 本研究主要探讨circ_0000527是否通过靶向调控miR-1253表达影响结直肠癌细胞的增殖、迁移及侵袭.

1 材料和方法

1.1 材料

收集2020-03/2020-08本院收治的经病理学诊断确诊为41例结直肠癌患者, 癌组织及其癌旁组织标本, 置于-80 ℃超低温冰箱内保存. 女20例, 男21例, 年龄(50-68)岁, 平均年龄(56.32±4.19)岁.

人结直肠癌细胞SW620(美国ATCC); Trizol试剂、Lipofectamine™ 3000转染试剂(美国Invitrogen); 反转录与荧光定量PCR试剂盒(北京天根生化); si-NC、si-circ_0000527、miR-NC、miR-1253 mimics、pcDNA、pcDNA-circ_0000527、anti-miR-NC、anti-miR-1253(上海吉玛); CCK-8试剂盒(北京索莱宝); Matrigel基质胶(美国BD); Transwell小室(美国Corning); 兔抗人E-cadherin、N-cadherin抗体、GAPDH(美国Abcam); 二抗(北京中杉金桥生物).

1.2 方法

1.2.1 实验分组: 将miR-NC、miR-1253 mimics、si-NC、si-circ_0000527分别转染至SW620细胞, 分别记为miR-NC组、miR-1253组、si-NC组、si-circ_0000527组. 采用脂质体转染法将si-circ_0000527和anti-miR-NC、si-circ_0000527和anti-miR-1253分别共转染至SW620细胞, 分别记为si-circ_0000527+anti-miR-NC组、si-circ_0000527+anti-miR-1253组.

1.2.2 qRT-PCR检测circ_0000527、miR-1253的表达水平: 采用Trizol试剂分别提取癌旁组织、结直肠癌组织与SW620细胞总RNA. 应用紫外分光光度计测定RNA浓度. 反转录合成cDNA. qRT-PCR扩增反应体系: cDNA 2 μL, Real-Time Master Mix 10 μL, 正反向引物各1 μL, RNase-Free ddH₂O补足体系至20 μL; 反应条件: 95 ℃ 2 min, 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 1 min, 72 ℃ 30 s(循环40次). 应用ABI StepOnePlus荧光定量PCR仪检测circ_0000527、miR-1253相对表达量.

1.2.3 CCK-8实验检测细胞增殖: 各组SW620细胞接种于96孔板, 每孔加CCK-8 10 μL, 培养2 h, 应用酶标仪检测各孔在450 nm处的光密度值(OD).

1.2.4 平板克隆形成实验: 取各组SW620细胞接种于6孔板(500个/孔), 于培养箱内培养直至出现肉眼可见的细胞克隆团, 每隔2 d更换一次培养基, 弃培养基, 预冷PBS洗涤, 加入500 μL甲醇固定20 min, 加入400 μL 1%结晶紫染色液染色15 min, 蒸馏水洗涤后晾干, 拍照并观察细胞克隆形成数.

1.2.5 划痕实验: 收集各组SW620细胞接种于6孔板(2×10⁵个/孔), 于培养箱内培养直至细胞长满, 用200 μL移液枪枪头在细胞单层划一道痕, 于显微镜下拍照并记录(0 h), 于培养箱内培养24 h后取出6孔板后再次于显微镜下拍照, 应用ImageJ软件检测各组细胞迁移距离并计算细胞划痕愈合率[0 h划痕宽度-24 h划痕宽度/0 h划痕宽度×100%].

1.2.6 Transwell实验检测细胞侵袭: 取Matrigel基质胶稀释液加入小室的上室(40 μL/孔), 于培养箱内固定5 h, 收集各组SW620细胞接种于上室(1×10⁵个/孔), 下室加入600 μL含有10%胎牛血清的培养液, 于培养箱内培养48 h, 弃培养液, PBS洗涤, 加入500 μL 4%多聚甲醛固定20 min, 1%结晶紫染色液染色10 min, PBS洗涤后晾干, 于显微镜下统计侵袭细胞数.

1.2.7 双荧光素酶报告实验检测circ_0000527与miR-1253的靶向关系: 美国Promega公司构建野生型载体WT-circ_0000527和缺失miR-1253结合区域的突变型载体MUT-circ_0000527, 采用脂质体转染法将miR-NC/WT-circ_0000527、miR-NC/MUT-circ_0000527、miR-1253 mimics/WT-circ_0000527、miR-1253 mimics/MUT-circ_0000527共转染至SW620细胞, 培养24 h后收集细胞并检测细胞相对荧光素酶活性. 采用脂质体转染法将pcDNA、pcDNA-circ_0000527、si-NC、si-circ_0000527分别转染至SW620细胞, 培养48 h后收集细胞, 用qRT-PCR法检测miR-1253的表达量.

1.2.8 Western blot检测E-cadherin、N-cadherin蛋白表达量: PBS洗涤各组SW620细胞后加入400 μL RIPA裂解液提取细胞总蛋白, 采用BCA法检测蛋白浓度. 每孔道加入40 μg蛋白进行SDS-PAGE, 将分离的蛋白凝胶转移至PVDF膜, 用5%脱脂牛奶室温封闭PVDF膜2 h, 分别加入E-cadherin(1:1000)、N-cadherin(1:1000)一抗与内参GAPDH抗体(1:2000)稀释液, 4 ℃孵育24 h, TBST洗涤, 加入1:3000稀释的二抗后, 37 ℃孵育2 h, 滴加ECL, 暗室内曝光显影, 应用Quantity One软件对蛋白条带进行定量.

统计学处理 采用SPSS 21.0统计学软件分析数据, 计量资料以(mean±SD)表示, 两组间比较采用独立样本t检验, 多组间比较采用单因素方差分析, 多组间两两比较可用LSD检验, 以P＜0.05为差异具有统计学意义.

2 结果

2.1 circ_0000527和miR-1253在结直肠癌组织中的表达

结直肠癌组织中circ_0000527的表达量高于癌旁组织(P＜0.05), miR-1253的表达量低于癌旁组织(P＜0.05), 表1.

表1 circ_0000527和miR-1253在结直肠癌组织中的表达(mean±SD, n = 41).

分组	circ_0000527	miR-1253
癌旁组织	1.00±0.09	1.00±0.15
结直肠癌组织	3.43±0.29a	0.39±0.03a
t	51.243	25.534
P	0.000	0.000

^aP<0.05, 与癌旁组织比较.

2.2 干扰circ_0000527表达对结直肠癌SW620细胞增殖的影响

转染si-circ_0000527可降低细胞增殖、克隆形成能力(P＜0.05), 见图1、表2.

图1 干扰circ_0000527表达抑制结直肠癌SW620细胞克隆形成的影响.

表2 干扰circ_0000527表达抑制结直肠癌SW620细胞增殖(mean±SD, n = 9).

分组	circ_0000527	OD值(450nm)	细胞克隆形成数(个)
si-NC	1.00±0.00	0.67±0.05	102.49±9.13
si-circ_0000527	0.24±0.03a	0.31±0.03a	46.54±4.32a
t	76.000	18.522	16.618
P	0.000	0.000	0.000

^aP<0.05, 与si-NC组比较.

2.3 干扰circ_0000527表达对结直肠癌SW620细胞迁移、侵袭的影响

转染si-circ_0000527可降低划痕愈合率、侵袭细胞数, 促进E-cadherin表达, 抑制N-cadherin表达(P＜0.05), 见图2、表3.

图2 干扰circ_0000527表达对结直肠癌SW620细胞迁移、侵袭的影响. A: 干扰circ_0000527表达对结直肠癌SW620细胞迁移、侵袭相关蛋白表达的影响; B: 干扰circ_0000527表达对结直肠癌SW620细胞迁移的影响; C: 干扰circ_0000527表达对结直肠癌SW620细胞侵袭的影响.

表3 干扰circ_0000527表达对结直肠癌SW620细胞迁移、侵袭的影响(mean±SD, n = 9).

分组	划痕愈合率(%)	侵袭细胞数(个)	E-cadherin蛋白	N-cadherin蛋白
si-NC	64.44±5.18	121.22±11.29	0.25±0.02	0.58±0.04
si-circ_0000527	23.14±2.28a	55.69±5.08a	0.74±0.06a	0.18±0.02a
t	21.892	15.879	23.243	26.833
P	0.000	0.000	0.000	0.000

^aP<0.05, 与si-NC组比较.

2.4 circ_0000527靶向调控miR-1253的表达

circ_0000527序列中与miR-1253存在互补核苷酸序列, 图3. 与miR-NC组相比, miR-1253降低WT-circ_0000527荧光素酶活性(P＜0.05), 表4. circ_0000527可负向调节miR-1253表达(P＜0.05), 表5.

图3 circ_0000527的序列中含有与miR-1253互补的核苷酸序列.

表4 双荧光素酶报告实验(mean±SD, n = 9).

分组	WT-circ_0000527	MUT-circ_0000527
miR-NC	0.98±0.06	0.99±0.06
miR-1253	0.36±0.03a	0.96±0.05
t	27.727	1.152
P	0.000	0.266

^aP<0.05, 与miR-NC组比较.

表5 circ_0000527调控miR-1253的表达(mean±SD, n = 9).

分组	miR-1253
pcDNA	1.00±0.00
pcDNA-circ_0000527	0.42±0.05a
t	34.800
P	0.000
si-NC	0.97±0.06
si-circ_0000527	2.86±0.22b
t	24.865
P	0.000

^aP<0.05, 与pcDNA组比较;

^bP<0.05, 与si-NC组比较.

2.5 miR-1253过表达对结直肠癌SW620细胞增殖、迁移、侵袭的影响

转染miR-1253 mimics可减弱SW620细胞OD值、克隆形成、划痕愈合率、侵袭细胞数, 并可促进E-cadherin表达, 抑制N-cadherin表达(P＜0.05), 图4、表6.

图4 miR-1253过表达抑制结直肠癌SW620细胞增殖、迁移、侵袭. A: miR-1253过表达抑制结直肠癌SW620细胞的克隆形成; B: miR-1253过表达对结直肠癌SW620细胞迁移、侵袭相关蛋白表达的影响; C: miR-1253过表达抑制结直肠癌SW620细胞迁移; D: miR-1253过表达抑制结直肠癌SW620细胞侵袭.

表6 miR-1253过表达抑制结直肠癌SW620细胞增殖、迁移、侵袭(mean±SD, n = 9).

分组	miR-1253	OD值(450nm)	细胞克隆形成数(个)	划痕愈合率(%)	侵袭细胞数(个)	E-cadherin蛋白	N-cadherin蛋白
miR-NC	1.00±0.00	0.69±0.05	105.17±10.84	67.17±5.14	123.43±10.61	0.23±0.02	0.57±0.04
miR-1253	3.62±0.23a	0.40±0.04a	53.98±4.94a	31.58±3.15a	62.32±5.86a	0.69±0.05a	0.26±0.02a
t	34.174	13.587	12.891	17.711	15.125	25.626	20.795
P	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000

^aP<0.05, 与miR-NC组比较.

2.6 下调miR-1253表达逆转了干扰circ_0000527表达对结直肠癌SW620细胞增殖、迁移、侵袭的作用

共转染si-circ_0000527、anti-miR-1253可逆转si-circ_0000527对SW620细胞生物学行为的作用(P＜0.05), 见图5、表7.

图5 下调miR-1253表达逆转了干扰circ_0000527表达对结直肠癌SW620细胞增殖、迁移、侵袭的作用. A: 下调miR-1253表达逆转了干扰circ_0000527表达对结直肠癌SW620细胞克隆形成的作用; B: 下调miR-1253表达逆转了干扰circ_0000527表达对结直肠癌SW620细胞迁移、侵袭相关蛋白表达的作用; C: 下调miR-1253表达逆转了干扰circ_0000527表达对结直肠癌SW620细胞迁移的作用; D: 下调miR-1253表达逆转了干扰circ_0000527表达对结直肠癌SW620细胞侵袭的作用.

表7 下调miR-1253表达逆转了干扰circ_0000527表达对结直肠癌SW620细胞增殖、迁移、侵袭的作用(mean±SD, n = 9).

分组	miR-1253	OD值(450nm)	细胞克隆形成数(个)	划痕愈合率(%)	侵袭细胞数(个)	E-cadherin蛋白	N-cadherin蛋白
si-circ_0000527+anti-miR-NC	1.00±0.00	0.30±0.03	44.96±4.25	22.14±2.16	53.32±5.16	0.77±0.06	0.17±0.03
si-circ_0000527+anti-miR-1253	0.26±0.03a	0.58±0.05a	89.68±6.82a	56.79±5.48a	110.59±10.31a	0.34±0.03a	0.47±0.04a
t	74.000	14.406	16.699	17.648	14.902	19.230	18.000
P	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000	0.000

^aP<0.05, 与si-circ_0000527+anti-miR-NC组比较.

3 讨论

circRNA是通过反向剪接形成的一种闭合环状结构, 其不易被核酸外切酶降解, circRNA具有稳定性与保守性, circRNA可调控结直肠癌细胞增殖、迁移及侵袭等生物学行为[7,8]. circRNA与miRNA竞争性结合而调控基因表达从而参与结直肠癌发生及发展过程, 并可能作为结直肠癌靶向治疗的潜在靶点[9].

本研究结果显示, 结直肠癌组织中circ_0000527的表达量上升. circ_0000527在视网膜母细胞瘤组织和细胞中高表达, 过表达circ_0000527可促进视网膜母细胞瘤细胞的增殖、迁移和侵袭, 抑制细胞凋亡[10,11]. circ_0000527在视网膜母细胞瘤细胞中表达上调, 并可通过充当miR-646的海绵分子而促进BCL-2表达从而促进视网膜母细胞瘤细胞增殖、迁移及侵袭[12]. 本研究结果显示, 干扰circ_0000527表达可降低结直肠癌细胞活力, 细胞克隆形成数减少, 提示干扰circ_0000527可抑制结直肠癌细胞增殖及克隆形成. 间充质细胞标志物N-cadherin与上皮细胞标志物E-cadherin是上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的主要标志物, EMT转化可促使迁移及侵袭发生[13]. 本研究结果显示, 干扰circ_0000527可降低结直肠癌细胞划痕愈合率、侵袭细胞数, 并可下调N-cadherin表达, 上调E-cadherin表达, 提示干扰circ_0000527表达可抑制结直肠癌细胞迁移及侵袭, 其作用机制与调节EMT有关.

本研究证实circ_0000527与miR-1253存在靶向调控作用, circ_0000527可通过吸附miR-1253而发挥作用. 研究表明[14], miR-1253在非小细胞肺癌组织中下调表达, 上调其表达可抑制非小细胞肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭. miR-1253在非小细胞肺癌中表达水平降低, 上调其表达可抑制非小细胞肺癌细胞增殖及转移[15]. miR-1253过表达可抑制乳腺癌细胞生长[16]. 本研究结果显示, 结直肠癌组织中miR-1253的表达量低于癌旁组织, 下调miR-1253表达可降低干扰circ_0000527表达对结直肠癌细胞增殖、克隆形成、迁移及侵袭的抑制作用. 提示circ_0000527可通过负向调控miR-1253表达影响结直肠癌细胞结直肠癌的发展进程.

4 结论

综上所述, circ_0000527可竞争性结合miR-1253, 干扰circ_0000527表达可通过上调miR-1253表达而抑制结直肠癌细胞增殖、克隆形成、迁移及侵袭, circ_0000527/miR-1253分子轴在结直肠癌发生及发展过程中可能发挥重要调控作用.

文章亮点

实验背景

circRNA可参与结直肠癌发生发展过程, 可作为结直肠癌诊断、治疗靶点, 并调控miRNA表达进而调节结直肠癌细胞生物学行为, 目前circ_0000527对结直肠癌细胞生物学行为的影响尚未可知.

实验动机

Circular RNA Interactome预测显示circ_0000527与miR-1253可能存在靶向调控关系, miR-1253在结直肠癌中发挥抑癌基因作用, circ_0000527/miR-1253轴是否可参与结直肠癌发生发展过程尚需进一步阐明.

实验目标

circ_0000527通过靶向调控miR-1253表达影响结直肠癌细胞的增殖、迁移及侵袭.

实验方法

qRT-PCR法检测结直肠癌患者的癌组织及其癌旁组织标本中circ_0000527、miR-1253的表达量; 将人结直肠癌细胞SW620分为si-NC组、si-circ_0000527组、miR-NC组、miR-1253组、si-circ_0000527+anti-miR-NC组、si-circ_0000527+anti-miR-1253组; CCK-8、平板克隆形成、划痕实验、Transwell实验检测增殖、克隆形成、迁移和侵袭; 双荧光素酶报告实验检测circ_0000527与miR-1253靶向.

实验结果

结直肠癌组织中circ_0000527上调表达, miR-1253下调表达, 抑制circ_0000527或miR-1253过表达可减弱细胞增殖、克隆形成、迁移及侵袭能力, 证实circ_0000527可靶向调控miR-1253表达, 下调miR-1253表达可减弱抑制circ_0000527表达对细胞增殖、克隆形成、迁移及侵袭能力的抑制作用.

实验结论

circ_0000527表达可通过抑制miR-1253表达而促进结直肠癌细胞增殖、克隆形成、迁移及侵袭.

展望前景

circ_0000527/miR-1253可能作为结直肠癌分子靶向治疗的潜在靶点.

备注

学科分类: 胃肠病学和肝病学

手稿来源地: 浙江省

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科学编辑:张砚梁 制作编辑:张砚梁

参考文献

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