修回日期: 2018-02-03
接受日期: 2018-02-10
在线出版日期: 2018-03-18
结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是一种发病率及死亡率较高的恶性肿瘤, 高死亡率主要由结肠癌转移到远处器官引起, 而肝转移是CRC患者的主要死因. 合适的动物模型是研究CRC的转移机制、评估其临床前期治疗效果的基础. CRC肝转移的原位移植模型具有相似度高, 更能体现人类CRC肝转移的特征. 本文我们就结肠癌肝转移原位移植模型作一综述.
核心提要: 本文全面概括了小鼠结直肠癌(colorectal cancer, CRC)肝转移原位瘤模型的最新进展. 介绍了动物模型概述、诱发模型、基因工程模型. 阐述同种种植及移植种植模型的优缺点. 对不同原位种植部位模型进行了对比及阐述了优缺点, 并提出通过小鼠活体肠镜平台建立CRC肝转移模型的构想.
引文著录: 欧阳国庆, 潘光栋, 吴永融, 徐洪来. 覆小鼠结直肠癌肝转移原位瘤模型. 世界华人消化杂志 2018; 26(8): 512-517
Revised: February 3, 2018
Accepted: February 10, 2018
Published online: March 18, 2018
Colorectal cancer (CRC) is a malignancy with high incidence and mortality, and its high mortality rate is mainly attributed to metastases, with liver metastasis being the main cause of death. Appropriate animal models can provide a basis for studying the metastatic mechanism of colorectal cancer and assessing pre-clinical therapeutic effects. Orthotopic transplantation models that simulate colorectal cancer with liver metastases can better reflect the characteristic of liver metastasis in colorectal cancer. In this article, we review orthotopic transplantation models of liver metastases of colorectal cancer.
- Citation: Ou-Yang GQ, Pan GD, Wu YR, Xu HL. Orthotopic mouse models of colorectal cancer liver metastases. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2018; 26(8): 512-517
- URL: https://www.wjgnet.com/1009-3079/full/v26/i8/512.htm
- DOI: https://dx.doi.org/10.11569/wcjd.v26.i8.512
在世界范围内, 结直肠癌(colorectal cancer, CRC)在所有肿瘤的发病率中位列第3位, 在癌症引起的死亡中占第4位[1,2]. 全球每年新发病例数超过100万, 病死率接近50%(2002年死亡人数为529000)[3]. 到2035年全球CRC发病率人数达到240万, 死亡人数达到130万. 目前, 中国新发的CRC患者占世界新发CRC患者的18.6%, 死亡人数占世界的20%[4]. 2006-2009年, CRC发病率位居我国恶性肿瘤第3位, 死亡率为第5位[5]. 我国2012年CRC新发病例为245000例, 死亡病例为139000例[6]. 高死亡率主要由CRC转移到远处器官引起, 而肝脏转移是引起CRC患者死亡的主要原因[7,8]. 在初次确诊的患者中, 已有15%-25%出现了肝转移, 约20%的患者在治疗中发生肝转移, 而在CRC的整个发病过程中肝转移的发生率将近70%[9], CRC肝转移患者若不治疗, 中位生存期仅有5-10 mo, 可见肝转移是CRC的主要死因[10]. CRC肝转移的治疗方式主要有手术、化疗、放疗、射频消融、微波消融、冷冻疗法, CRC肝转移的治疗方式主要有手术、化疗、放疗、射频消融、微波消融、冷冻疗法、经导管肝动脉化疗栓塞(transcatheter arterial chemoembolization, TACE)、光动力治疗[11]. 手术治疗仍然是公认的最有效的治疗方式, 但CRC肝转移患者初诊时仅10%-25%具备手术指征[12], 因此迫切需要研发能改善CRC肝转移患者预后的治疗方式. 研究CRC发生及肝转移的机制和特性对于研发有效的治疗方式、提高远处转移患者的生存率具有十分重要的意义, 而合适的动物模型是研究CRC的转移机制、评估其临床前期治疗的安全性及有效性的基础. 本文就小鼠CRC肝转移原位瘤模型的进展、优缺点进行综述.
近些年来, 研究肿瘤发生、发展和转移的模型有基因工程模型和自发种植瘤模型. 肿瘤动物模型根据种植细胞来源分为同种移植和异种移植[13]. 根据移植的部位分为原位移植和异位移植[14]. 小鼠异位移植模型按移植部位不同分为脾脏种植、肝脏种植、皮下种植、门静脉种植、腹腔种植等[15-17]. 脾脏、肝脏、皮下种植等异位种植模型虽然在肝脏的成瘤速度快, 但肿瘤的快速生长会导致小鼠的生存周期缩短, 不利于后续的治疗及其疗效的观察[15-17]. 原发肿瘤只有具备高度侵袭性, 才能在转移过程穿过若干层屏障(如黏膜层、黏膜下层、肌层、浆膜层)到达远处部位形成转移瘤[13], 才能更好地模拟人类CRC的转移过程. 相比于异位种植瘤, 原位瘤转移能力更强[18], 更能体现人类CRC肝转移的特性. 为了更好地研究CRC肝转移的自然进程和临床前期治疗, 小鼠的原位瘤模型是最恰当的选择.
诱发模型是指通过致癌物质诱发小鼠成瘤而构建实验模型. 目前诱发模型应用最广泛的是化学致癌物质. 当前使用的致癌物质主要有二甲肼、氧化偶氮甲烷、亚硝胺、芳香族类等. 化学物诱导模型具有高效、可重复、操作简单和研究费用低等优点[18]. 而且, 诱导模型与人CRC细胞的组织病理学特征具有许多相似性[19]. 虽然诱发模型能高度模拟人结直肠肿瘤的特性, 但其具有缺乏黏膜侵袭性、成瘤周期长、发生转移率低、所需的小鼠数目较多并具有不可预测性等缺点[20-22]. 因此该模型用于转移方面的研究存在一定的局限性.
基因工程模型是运用基因重组、转基因、基因敲除等技术改变小鼠正常基因, 诱发肿瘤. 基因工程模型很好地模拟体内生理、病理环境、肿瘤起始和进展的过程[23], 并且具有遗传性, 小鼠出生就可投入研究使得研究周期缩短. 1990年Moser等[24]运用APC基因突变构建了ApcMin/+模型, 此模型为后续的许多研究提供了重要的工具[25]. 在这个基础上, 建立了不同APC基因突变的模型, 如Apc1638N/+[26]、ApcΔ14/+[27]等. 尽管传统基因敲除为基因研究体功能提供了良好的条件, 但其往往导致功能完全缺失和传代困难等缺点[28], 为了克服此缺点, Gu等[29]运用Cre/LoxP原理建立了条件性基因敲除模型. 条件性基因敲除模型可以使小鼠区域性和暂时性的增加和缺失某些功能. Kucherlapat等运用条件性基因敲除方法将VCMsh2LoxP/LoxP小鼠和携带Villin-Cre的小鼠交配繁殖获得了较好的肠癌模型. 虽然基因工程模型为我们研究肠癌提供重要工具, 但其自发瘤很少能像人类一样发生肝、肺、淋巴结转移[30], 因此很少运用到CRC肝转移的研究.
同种移植是指所用的细胞株、组织块与宿主来源于同一种属, 这使得宿主不排斥转移细胞株/肿瘤块, 因此不需要免疫抑制[31]. 与异种移植相比, 同种移植保存了小鼠正常免疫功能, 因此可养殖于普通环境下, 使其具有延长小鼠生存时间、降低研究费用等优点, 适合用于饲养条件差、研究周期长和研究资金不充足的临床前期研究, 尤其适于免疫学方面的研究. 同种移植可高度模拟在免疫功能正常情况下肿瘤发生、发展、侵袭、转移的微环境变化, 因此有利于肿瘤微环境的研究. 然而, 同种移植未能完全呈现出人肿瘤的临床特征, 对于研究小鼠肿瘤细胞的转移也存在缺陷[32]. 如果治疗的药物或方式只针对人类肿瘤, 那么同种移植的小鼠模型将无用[33].
目前CRC肝转移同种移植所用的细胞有C26、CT26[34]、KI2/TR、DHD/K12/TRb[35]等, 其中以小鼠大肠癌CT26细胞株使用最广泛. 原位同种移植按照移植部位分为盲肠移植、结肠移植、直肠移植. CT26是一种具有高转移性小鼠结肠腺癌细胞株, 与人CRC细胞株相比, 其在小鼠体内能更精确的反应小鼠CRC肝转移的发生发展过程[36]. Donigan等[37]用钳子扩肛后, 在100×显微镜下分别将50 μL细胞浓度为2.5×104/mL、1×105/mL和1×106/mL的CT26细胞液用注射器分别注入据肛门>5 cm的远端直肠黏膜下层. 小鼠转移瘤及生存的最佳注射细胞浓度是2.5×104/mL, 过高的细胞浓度会导致高死亡率且不产生转移. 经直肠黏膜下层注射的肿瘤生长率为65%, 注射50 d后有两只小鼠(3.3%)发生了直肠癌肝转移. Zhang等[34]在对Balb/cByJ小鼠行正中切口后, 拉出盲肠, 将10-15 μL的细胞量为2×106的CT26细胞株注射入盲肠的浆膜下层; 1 wk后, Balb/cByJ小鼠的成瘤率为100%, 但仅有8%的小鼠在4-8 wk内发生自发性肝转移. 为了达到更高的转移率, Zhang等[34]从CT26母细胞群活体中筛选出发生高度肝转移的结肠癌细胞. 他们将2×106 CT26细胞在种植到小鼠皮下组织, 2 wk后将成瘤小鼠处死, 并用消化酶消化成单个细胞, 称为CT26-F1细胞株. 一段时间培养后将2×106 CT26-F1细胞株按上述方法种植于盲肠, 所有小鼠在4 wk后都有原发瘤形成, 40%小鼠发生肝转移. 将肝转移灶的肿瘤组织切下, 消化成单个细胞后再种植到盲肠. 如此往复循环3次将获得被称为CT26-FL3的高转移细胞株, 该细胞株原位移植于盲肠后或得高达90%的转移率.
同种移植使用的细胞株与宿主小鼠是相同种属, 不需要使用免疫抑制, 所以能更好地反应小鼠CRC发生肝转移时的免疫反应状态[38]和体内微环境对CRC肝转移发生发展的影响, 适用于CRC肝转移机制的研究.
异种移植是指宿主和移植细胞、肿瘤块种属不一致, 要求宿主是存在免疫缺陷的小鼠, 而移植细胞、肿瘤块主要来源于人, 其优点是使用了人类的细胞系, 允许直接研究人类的癌细胞、组织的特征. 如果我们的目标是研究药物的疗效, 那么异种移植将会非常有效, 因为人类和鼠类的细胞特性存在差异[33].
异种移植由于人类细胞和受体小鼠来自不同种属, 因此不能体现癌症上皮和细胞间质之间的重要交叉关系[23]. 异种移植的另一缺点是宿主存在免疫缺陷, 目前主要运用裸鼠和SCID鼠. 裸鼠是指缺乏胸腺T细胞的小鼠, 而SCID鼠是无T细胞和B细胞的小鼠[39,40]. 此两种免疫缺陷的小鼠价格昂贵、养殖环境要求高, 抵抗肿瘤能力弱、生存时间短. 裸鼠或者SCID鼠都是缺乏免疫细胞的, 若某项治疗措施主要通过免疫发挥治疗作用, 那么异种移植瘤就不合适[33,39]. 但是, 因为宿主是缺乏免疫的, 所以缺乏宿主对移植细胞的免疫作用, 使得移植细胞在整个肿瘤形成和转移过程中能很好的保持肿瘤细胞的原始特性. 有研究者[41,42]把CRC患者手术切下来的瘤块移植到Balb/c裸鼠皮下, 一段时间后, 经免疫组化分析显示出了, 移植肿瘤块保持了患者的病理学特征; 而通过分子鉴定得出了异种移植的肿瘤保持了与其来源的患者基因突变、基因组改变、基因表达的一致性的结论.
异种移植模型原发肿瘤的肝转移的发生发展过程反应了人CRC患者癌转移的生物学特性, 异种移植瘤模型对于临床前期药物的评估存在非常重要的意义. 目前原位异种移植所用的人CRC细胞有LoVo、HCT116、LS174T、HT29、DLD-1、SW480、SW620等, 以及来自患者的肿瘤块仍可以用于模型的建立, 而原位异种移植同样也可以移植到盲肠移植、结肠和直肠.
异种移植的宿主是缺乏免疫功能的小鼠, 因此其发生肝转移时间短、成功率高. Rajput等[43]运用4-6 wk的Balb/c裸鼠种植人的肠癌细胞HCT116于盲肠和降结肠, 4 wk时发现肝转移现象, 总的肝转移率为59%. Wang等[44]通过脾内注射人结肠癌细胞SW620到无胸腺小鼠脾脏中, 待小鼠成瘤后, 腹腔注射银杏叶提取物(extract of ginkgo biloba, EGb)和PBS 5 wk. 相比对照组, EGb组显著增加了小鼠肝转移率, 且能降低肝转移细胞的坏死及凋亡率. 研究显示EGb主要通过激活MAPK途径增加肝转移率. 因此当需要增加肝转移率时, 可通过某些药物激活MAPK途径.
4.3.1 盲肠或结肠种植: 目前, 使用较多的原位模型主要是小鼠的盲肠和结肠, 以其操作简单而被广泛使用. 将小鼠麻醉后行下腹部2 cm左右的正中切口并将盲肠拉出腹腔外, 于浆膜层进针, 缓慢注射人CRC细胞(约2 min), 注射完后用75%的酒精棉球轻压注射部位, 以防止癌细胞流出播散到腹腔[13,45,46]. Céspedes等[46]在双目显微镜下用微吸管分别将细胞量为2×106/mL的HCT116、DLD-1、SW620细胞株按上述方法注入显露的盲肠. HCT116和SW620原位成瘤率为75%, DLD-1肿瘤细胞成瘤率为88%, 130 d后3种细胞发生肝转移的概率分别为67%、0、29%, 说明三种细胞中HCT116的侵袭能力最强. 为了对比脾脏注射与盲肠注射发生肝转移率的差别, Lee等[45]将2×106 /50 μL的HCT116细胞按上述方法分别注入脾脏和盲肠. 向脾脏注射细胞发生肝转移率为100%, 而从盲肠注射小鼠在25 d时有1只死于肿瘤, 余下来发生肝转移率的为57%, 本研究说明肝转移率随注射部位不同而发生改变, 脾脏注射转移率比盲肠高, 因此脾脏注射适用于实验时间短的研究. 盲肠注射能更好模拟肠道肿瘤发生肝转移的生物学过程, 因此盲肠成瘤适用于研究时间充足、更有针对性的研究. 盲肠注射种植是目前原位移植使用最多的部位, 与直肠种植相比其操作简单、难度较小、肝转移率高. 但盲肠注射种植存在以下缺点: (1)注射类器官不一定形成肿瘤; (2)相比剩余的结肠, 盲肠种植部位微环境变化较大; (3)盲肠种植会产生广泛的腹腔转移, 从而缩短小鼠生存期[47].
为了进一步缩短发生肝转移的时间, Rajput等[13]将荧光标记的GEO细胞先种植到裸鼠皮下, 待其成瘤后将肿瘤块切成1-2 mm3的碎片, 按上述方法种植到盲肠和降结肠, 4-5 wk出现原位瘤, 7-8 wk发生肝转移. 本模型能很好的反应人CRC患者在原发肿瘤发生后出现肝转移的特性, 对于临床前期药物研究提供了重要工具, 此外此类模型可用于在CRC发展及保存过程基因改变的研究. 盲肠注射种植是目前原位移植使用最多的部位, 与直肠种植相比其操作简单、难度较小、肝转移率高. 但盲肠注射种植存在以下缺点: (1)注射类器官不一定形成肿瘤; (2)相比剩余的结肠, 盲肠种植部位微环境变化较大; (3)盲肠种植会产生广泛的腹腔转移, 从而缩短小鼠生存期.
目前, 盲肠种植模型主要是把细胞/肿瘤块种植到浆膜上, 因此无法模拟人CRC从黏膜下层侵袭到浆膜的过程[45,46]. 为了克服此缺点, Karas等[48]在肠镜下将细胞悬液注射到BD-IX大鼠盲肠的黏膜下层, 构建模型. Roper等[49]同样在小鼠电子结肠镜下通过特定的注射器将肿瘤细胞注射到结肠黏膜构建动物模型. 通过小鼠肠镜构建小鼠CRC肝转移模型可不破坏黏膜, 且能很好的模拟肿瘤转移的全过程, 但其操作难度大、转移率低、而未得到普及[47]. 本团队关于小鼠活体肠镜平台的建立也为国内小鼠肠镜平台下建立CRC肝转移模型建立了基础[25].
4.3.2 直肠种植模型: 盲肠种植具有方便操作和转移率高的优点, 但其主要是把细胞种植到浆膜, 这就无法体现出肠癌是通过黏膜穿侵袭到浆膜发生转移的过程. 而通过直肠种植的细胞/肿瘤块可以种植到黏膜层, 所以直肠种植模型是最能模拟人CRC发生转移过程的. 此法的步骤是将肛门部直肠区前壁剪7 mm的口子(为了防止因为肿瘤生长而发生的梗阻), 然后把细胞注入直肠后壁的黏膜下层[50,51]. Tsutsumi等[50]运用此法将4种人CRC细胞株注射到直肠的黏膜下层, 7 d后所有小鼠的接种部位都成瘤, 6 wk后发生腹主动脉周围淋巴结转移, 但70 d后仍未发生任何器官的转移. Kawakami等[51]运用此法也将人细胞株DLD-1注射到黏膜下层, 也只发生了淋巴结转移. 王跃等[52]将CT26注射入Balb/c小鼠直肠黏膜层, 发生肝转移率为30%, 小鼠平均生存天数为20 d±5 d. 杨剑锋等[15]分别将0.1、0.2、0.3、1.0 mL细胞量为106/mL的CT26细胞种植到Balb/c小鼠直肠黏膜, 发生肝转移率分别为50.0%、 53.1%、16.7%、6.7%. 虽然直肠种植模型与人肠癌相似性更大, 但小鼠直肠种植模型发生的肝转移率比盲肠/结肠模型发生肝转移率低, 不利于临床前期的研究, 因此提高转移效率是将此模型应用于临床前期研究的基础.
细胞注射法的优点是能很好的模拟CRC发生血性转移和淋巴转移等晚期过程, 而且操作简单易于掌握、对小鼠造成的损伤小; 缺点是癌细胞容易播种到腹腔, 且成瘤效率没有组织块接种高, 所需时间长. 组织(肿瘤)块接种首先得将细胞接种到小鼠皮下, 形成皮下移植瘤后将肿瘤切除, 并切成1 mm3左右的瘤块, 再将此瘤块种植到盲肠或直肠[13]. 此法的优点在于肿瘤的恶性程度和侵袭性高, 所需时间短; 不足是相比于细胞注射法会花费更长的操作时间, 操作更加复杂使得操作失误的几率增大, 更为重要的是在皮下种植过程中可能会改变细胞的本质属性[46], 影响试验结果. 大量研究证明, 在小鼠CRC肝转移过程中, 应用组织学完整的瘤块种植比用肿瘤细胞悬液注射发生的肝脏转移率高[53].
小鼠具有体积小、易于饲养和操作、价格便宜、高肿瘤发生率、肿瘤生长时间短以及基因组与人类相似度高的优点使得其成为研究人类肿瘤的一个良好的工具. 目前国内外关于CRC肝转移模型的研究比较成熟, 把小鼠模型的研究作为临床前期的研究是必不可少的, 模型的研究为人CRC肝转移发生发展的分子机制、形态学、及其预防和治疗的研究提供良好的媒介. 一个理想的小鼠模型是能模拟人CRC肝转移所有方面的状况: 能反应出在人类药物剂量、体内积聚、药效、药物之间作用和毒性之间的潜在关系. 尽管, 目前很多CRC肝转移模型为临床前期研究提供了良好的工具, 但是许多模型仅能模拟人癌症发生发展的某些过程, 使得在模型上面的研究成果未能很好的应用到临床实践当中, 因此一个能很好模拟人CRC肝转移发生发展的模型仍需进一步研究.
学科分类: 胃肠病学和肝病学
手稿来源地: 广西壮族自治区
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编辑:闫晋利 电编:闫晋利
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