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世界华人消化杂志. 2017-05-18; 25(14): 1248-1254
在线出版日期: 2017-05-18. doi: 10.11569/wcjd.v25.i14.1248
氯化两面针碱对胃癌细胞株SGC7901凋亡的影响及初步机制
张婉君, 陈阳, 张娜
张婉君, 陈阳, 张娜, 台州恩泽医疗中心(集团)路桥医院药剂科 浙江省台州市 318050
张婉君, 药师, 主要从事临床药学方面的研究.
作者贡献分布: 张婉君进行课题设计、数据分析及论文写作; 陈阳与张娜负责数据收集; 张婉君负责论文撰写.
通讯作者: 张婉君, 药师, 318050, 浙江省台州市路桥区下里桥西路1号, 台州恩泽医疗中心(集团)路桥医院药剂科. wanjun147@163.com
电话: 0576-82518301
收稿日期: 2017-03-23
修回日期: 2017-04-14
接受日期: 2017-04-24
在线出版日期: 2017-05-18

目的

探讨氯化两面针碱对胃癌细胞株SGC7901凋亡的影响, 并研究其可能的初步机制.

方法

MTT法检测不同浓度氯化两面针碱(0、5、10、20和40 μmol/L)对胃癌细胞株SGC7901存活率的影响; Hoechst染色观察SGC7901细胞的形态学; Annexin V-FITC/PI双染法检测SGC7901细胞的凋亡; JC-1单标法检测细胞内线粒体膜电位变化; 免疫印迹法检测caspase-3剪切体、caspase-9剪切体和PARP剪切体与其各自未激活体的蛋白表达变化.

结果

SGC7901的存活率随着氯化两面针碱浓度的增加而逐渐下降, 并与时间呈正相关; Hoechst染色与Annexin V-FITC/PI双染法结果分别显示氯化两面针碱干预后SGC7901细胞的凋亡特征更显著, 细胞凋亡率明显增多; 经过氯化两面针碱处理后, SGC7901细胞线粒体膜电位显著下降, caspase-3剪切体、caspase-9剪切体和PARP剪切体蛋白表达水平显著上升, 其未激活体蛋白表达明显下降.

结论

氯化两面针碱呈浓度依赖性抑制SGC7901细胞的存活率, 增加细胞凋亡率, 可能是通过激活内源性线粒体通路有关.

关键词: 氯化两面针碱; 胃癌细胞株SGC7901; 凋亡; 线粒体

核心提要: 氯化两面针碱呈浓度依赖性抑制SGC7901细胞的存活率, 增加细胞凋亡率, 可能是通过激活内源性线粒体通路, 降低线粒体膜电位, 增加caspase-3剪切体、caspase-9剪切体和PARP剪切体蛋白表达水平而发挥作用.
引文著录: 张婉君, 陈阳, 张娜. 氯化两面针碱对胃癌细胞株SGC7901凋亡的影响及初步机制. 世界华人消化杂志 2017; 25(14): 1248-1254
Effect of nitidine chloride on cell apoptosis in gastric cancer cell line SGC7901
Wan-Jun Zhang, Yang Chen, Na Zhang
Wan-Jun Zhang, Yang Chen, Na Zhang, Department of Pharmacy, Luqiao Hospital, Taizhou Grace Medical Center (Group), Taizhou 318050, Zhejiang Province, China
Correspondence to: Wan-Jun Zhang, Pharmacist, Department of Pharmacy, Luqiao Hospital, Taizhou Grace Medical Center (Group), 1 Xialiqiao West Road, Luqiao District, Taizhou 318050, Zhejiang Province, China. wanjun147@163.com
Received: March 23, 2017
Revised: April 14, 2017
Accepted: April 24, 2017
Published online: May 18, 2017

AIM

To investigate the effect of nitidine chloride on cell apoptosis in gastric cancer cell line SGC7901, and to explore the underlying mechanisms.

METHODS

After SGC7901 cells were treated with different concentrations of nitidine chloride (0, 5, 10, 20 or 40 μmol/L), cell survival was determined by MTT assay, cell morphology was observed by Hoechst staining, cell apoptosis was measured by Annexin V-FITC/PI double staining, and mitochondrial membrane potential was examined by JC-1 staining. Furthermore, the expression of cleaved caspase-3, cleaved caspase-9, cleaved PARP and their respective un-cleaved protein was detected by Western blot.

RESULTS

Nitidine chloride decreased SGC7901 cell survival in a dose- and time-dependent manner. Hoechst and Annexin V-FITC/PI double staining showed increased apoptotic cells after nitidine chloride treatment. In addition, nitidine chloride treatment significantly increased the protein expression of cleaved caspase-3, cleaved caspase-9 and cleaved PARP, while the expression their respective un-cleaved protein was reduced.

CONCLUSION

Nitidine chloride can decrease SGC7901 cell survival and increase cell apoptosis possibly via inhibition of mitochondrial-dependent pathways.

Key Words: Nitidine chloride; SGC7901 cells; Apoptosis; Mitochondria
0 引言

胃癌是全世界范围内发病率最高的恶性肿瘤之一, 其发病率位居全球第4位, 全球每年约有73800人死于胃癌, 约占全球癌症死亡总数的9.7%, 死亡率仅次于肺癌, 位居第2位[1-3]. 早期胃癌不出现典型的临床表现, 所以大多数患者确诊后已经是中晚期, 恶性程度高, 复发率与转移率高, 预后不良, 5年后生存率仅为20%-30%[4-7]. 主要的临床治疗手段是手术、手术结合放疗以及分子生物学如靶向治疗等, 但这些治疗方式往往具有较大的不良反应, 治疗费用高, 给患者及家庭带来了沉重的负担[8,9]. 我国中医药及其有效成分具有安全可靠, 价格低廉, 来源广泛等优势, 越来越得到国内学者的广泛关注. 两面针是我国芸香科植物, 氯化两面针碱是其提取物中主要的有效成分, 属于苯骈菲啶类生物碱[10], 其结果是如图1所示. 研究[11]表明氯化两面针碱的抗肿瘤作用机制可能与其结构有关, 亲核基团与芳环对DNA碱基对的嵌入作用以及分子中正电荷与生物大分子上负电荷的静电作用. 另有学者研究[12,13]发现氯化两面针碱在体外对鼻咽癌细胞株, 肺癌细胞株与舌癌细胞株均有促进凋亡的作用.

图1
图1 氯化两面针碱结构式.
1 材料和方法
1.1 材料

细胞培养: 将冻存在液氮中的SGC7901细胞取出置于37 ℃水浴中, 融化后离心, 1500 r/min, 3 min, 弃去上清液, 接种于含10%胎牛血清的DMEM培养基中, 50 mL/L CO2、37 ℃饱和湿度的培养箱中孵育.

1.2 方法

1.2.1 MTT实验: 将处于对数生长期的SGC7901细胞用0.25%胰酶消化, 以1×104个/孔接种于96孔板中, 待细胞贴壁后, 采用无血清培养基孵育过夜, 分别加入氯化两面针碱溶液0、5、10、20和40 μmol/L, 分别培养24、36与48 h, 每个浓度设3个复孔, 分别加入5 mg/mL的MTT试剂20 μL, 37 ℃继续孵育4 h, 吸去孔内培养基, 每孔加入150 μL二甲基亚砜, 于酶标仪测定490 nm波长处的吸收值(OD). 存活率 = 给药组OD平均值/对照组OD平均值×100%.

1.2.2 Hoechst染色: 将处于对数生长期的SGC7901细胞以5×104个/孔接种于24孔板中分别加入5 mg/mL的MTT试剂20 μL, 37 ℃、50 mL/L CO2饱和湿度的培养箱中孵育36 h, 离心5 min, 1500 r/min, 弃去上清, 加入细胞固定液, 4 ℃固定10 min, PBS清洗2遍, 离心5 min, 1500 r/min, 吸去上清液, 加入5 μg/mL Hoechst33258染料, 室温下染色10 min. 于356 nm波长处, 荧光显微镜下观察细胞并拍照.

1.2.3 细胞凋亡测定: 将处于对数生长期的SGC7901细胞以5×104个/孔接种于24孔板中, 贴壁培养过夜, 采用氯化两面针碱处理后, 把细胞培养液吸去至离心管, 加入0.25%胰酶消化, 37 ℃孵育5 min, 终止消化, 吹打细胞, 离心3 min, 1500 r/min, 收集细胞, 用PBS重悬并计数, 使浓度为1×106的细胞悬液; 取100 μL细胞悬液依次加入5 μL Annexin V-FITC与5 μL PI, 轻轻混匀后室温下避光孵育15 min, 加入200 μL的上样缓冲液, 设置流式细胞仪激发光波长为488 nm, 发射波长为530 nm, 用荧光显微镜检测, 将细胞混合液离心, 取细胞沉淀涂片, 再进行观察.

1.2.4 线粒体膜电位检测: 采用JC-1单标法, 将处于对数生长期的SGC7901细胞以1×106个/孔接种于24孔板中, 加入相应浓度的氯化两面针碱处理后, 离心5 min, 1500 r/min, 弃上清, 加入5 pg/mL的JC-1, 37 ℃避光孵育20 min, 吸去上清液, 洗涤, 加入细胞培养液, 至于荧光显微镜下观察.

1.2.5 免疫印迹法: 离心收集经相应处理的各组细胞, 用无菌PBS缓冲液清洗, 吸去缓冲液后置于冰上, 加入预冷的裂解液, 静置30 min, 4 ℃离心10 min, 12000 r/min, 提取总蛋白并测定蛋白浓度, 每道加入50 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳, 电转至PVDF膜上, 将PVDF膜放置与5%脱脂奶粉封闭液中封闭1 h, TBST洗膜, 加入预先配制好的一抗稀释液, 4 ℃孵育过夜, TBST洗膜, 再加入二抗稀释液, 室温孵育1 h, 化学发光法显色, 成像扫描分析系统保存图像, 分析条带光密度值, 计算目的和内参条带的光密度值.

统计学处理 采用SPSS16.0软件对实验数据进行处理, 数据结果采用mean±SD表示, 方差分析采用单因素方差分析(ANOVA), 两组间均数比较采用独立样本的t检验, 以P<0.05为差异具有统计学意义.

2 结果
2.1 氯化两面针碱对胃癌细胞SGC7901存活率的影响

MTT法检测结果显示, 随着氯化两面针碱浓度增大, 对SGC7901X细胞存活抑制作用越明显, 存活率越低(P<0.05). 氯化两面针碱0 μmol/L、DMSO、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L和40 μmol/L培养SGC7901X细胞24 h后, SGC7901细胞存活率分别为100%、98.37%±3.57%、92.57%±4.67%、83.67%±4.67%、65.87%±3.15%和51.27%±2.67%. 其中, 20 μmol/L与40 μmol/L氯化两面针碱对SGC7901细胞存活率的抑制作用比较显著, 因此, 后续实验采用20 μmol/L与40 μmol/L浓度进行.

2.2 氯化两面针碱对胃癌细胞SGC7901形态学的影响

Hoechst染色结果显示, 空白对照组的SGC7901细胞的荧光均匀, 采用氯化两面针碱干预后的SGC7901细胞可见核染色质浓缩, 出现凋亡小体, 均为细胞凋亡的特征(图2).

图2
图2 氯化两面针碱对胃癌细胞SGC7901形态学的影响(×200). A: 对照组; B: DMSO; C: 20 μmol/L; D: 40 μmol/L.
2.3 氯化两面针碱对胃癌细胞SGC7901凋亡的影响

采用氯化两面针碱干预后, SGC7901细胞的凋亡率显著高于空白对照组, 由图3可以看出, 随着氯化两面针碱的浓度增大, 细胞凋亡率逐渐增大, 凋亡率的下降主要是因为早期和晚期的凋亡细胞均增多造成的.

图3
图3 氯化两面针碱对胃癌细胞SGC7901凋亡的影响. A: 对照组; B: DMSO; C: 20 μmol/L; D: 40 μmol/L.
2.4 氯化两面针碱对线粒体膜电位的影响

采用JC-1染色, 空白对照组的SGC7901细胞红色荧光很强, 绿色荧光极弱, 随着氯化两面针碱浓度的增加, SGC7901细胞的红色荧光逐渐减弱, 绿色荧光逐渐加强(图4).

图4
图4 氯化两面针碱对线粒体膜电位的影响. A: 对照组; B: DMSO; C: 20 μmol/L; D: 40 μmol/L.
2.5 cCaspase-3、cCaspase-9和cPARP蛋白表达的变化

与空白对照组相比, 给予氯化两面针碱干预的SGC7901细胞cCaspase-3、cCaspase-9和cPARP蛋白表达明显上调, Caspase-3、Caspase-9和PARP蛋白表达下调(图5).

图5
图5 cCaspase-3、cCaspase-9和cPARP蛋白表达的变化(n = 6, mean±SD). A: cCaspase-3、cCaspase-9和cPARP蛋白Western blot图; B: cCaspase-3、cCaspase-9和cPARP蛋白统计学数据. aP<0.05 vs 对照组.
3 讨论

细胞的增殖异常与永生化, 是恶性肿瘤细胞的最显著的生物学特点[14,15], 因此, 对于治疗恶性肿瘤的药物设计, 本实验主要从抑制胃癌细胞增殖与诱导细胞凋亡两个方面开展. 在肿瘤的综合治疗中, 中药以及其主要成分单体逐渐受到国内外科学家的重视, 氯化两面针碱是从常见天然中药提取的生物碱, 已有研究[16]表明, 氯化两面针碱对前列腺癌细胞的增殖与侵袭具有抑制作用, 但氯化两面针碱对胃癌细胞增殖与侵袭作用及其分子生物学通路尚未明确.

通过MTT实验发现, 随着氯化两面针碱浓度的增加, 胃癌细胞的存活率逐渐降低, 并与时间呈正相关, 提示氯化两面针碱能够明显抑制胃癌细胞的异常增殖. Hoechst染色结果显示随着氯化两面针碱浓度的升高, 细胞的凋亡特征形态出现的比例增多, Annexin V-FITC/PI双染法检测结果发现胃癌细胞的凋亡随着氯化两面针碱浓度的增加而逐步增高, 进一步证实了氯化两面针碱对胃癌细胞存活率的抑制作用.

细胞凋亡时, 线粒体膜的完整性遭受破坏, 通透性发生变化, 破坏线粒体跨膜电位[17-20], JC-1染色结果显示胃癌细胞随氯化两面针碱浓度增加, 线粒体膜电位逐步丧失, 提示氯化两面针碱可能是通过线粒体介导的细胞凋亡途径诱导胃癌细胞的凋亡. 进一步通过免疫印迹法显示, 采用氯化两面针碱干预后, 胃癌细胞的caspase-3剪切体与caspase-9剪切体成高表达, 同时PARP剪切体也呈高表达, 具有正相关性, 未被激活的caspase-3、caspase-9与PARP的表达显著减少. Caspase-3是抗凋亡蛋白Bcl-2的下游调控蛋白, 同时作为引起凋亡的始发因子[21-23], 近年研究[24-30]表明, PARP是Caspase-3的底物, Caspase-3激活后, 改变构象, 然后与活化子结合而被激活形剪切体cleaved-caspase-3, 同时剪切PARP, 使总PARP减少, cleaved-PARP增加, 导致其失去正常功能, 最终使得核小体间DNA降解, 细胞发生凋亡性死亡. 由本实验推测氯化两面针碱可能通过激活内源性线粒体通路, 加速胃癌细胞SGC7901的凋亡, 对此, 本实验可能为临床上辅助治疗胃癌提供了实验依据.

评论
背景资料

胃癌的发病率位居全球第4位, 全球每年约有73800人死于胃癌, 传统的治疗方式往往具有较大的不良反应, 治疗费用高, 给患者及家庭带来了沉重的负担. 有研究发现氯化两面针碱在体外对鼻咽癌细胞株, 肺癌细胞株与舌癌细胞株均有促进凋亡的作用.

研发前沿

本文的研究重点是对氯化两面针碱对SGC7901细胞增殖率与凋亡率的影响, 逐步探讨针对氯化两面针碱抑制胃癌细胞增殖与促进凋亡的作用机制, 以便发现作用靶点, 在临床上应用.

相关报道

现代研究证明两面针具有抗肿瘤、抗炎镇痛等作用. 氯化两面针碱是两面针的主要有效成分, 近年来研究发现两面针碱的抗肿瘤活性较强, 在抗肿瘤治疗方面具有比较广泛的开发利用价值和应用前景, 已有文献报道, 对LEWIS肺癌、人体鼻咽癌、肝癌、慢性粒细胞白血病均有抑制作用, 对小鼠艾氏水癌、肝癌腹水也有效.

创新盘点

已有研究发现氯化两面针碱在体外对鼻咽癌细胞株, 肺癌细胞株与舌癌细胞株均有促进凋亡的作用, 但本文首次针对氯化两面针碱对胃癌细胞的增殖与凋亡的作用, 并探讨其可能的作用机制.

应用要点

本文通过研究氯化两面针碱对胃癌细胞株SGC7901的增殖与凋亡的作用机制, 为后续在体外实验氯化两面针碱对胃癌细胞可能的作用靶点提供临床实验依据.

名词解释

线粒体: 动物细胞生成ATP的主要地点, 是促进细胞能量转换、参与细胞凋亡的重要细胞器.

同行评议者

孟繁杰, 教授, 主任医师, 上海中医药大学附属第七人民医院普外一科; 秦冬梅, 副教授, 石河子大学药学院

同行评价

本文内容比较新颖, 文稿思路清晰, 表述清楚.

手稿来源: 自由投稿

学科分类: 胃肠病学和肝病学

手稿来源地: 浙江省

同行评议报告分类

A级 (优秀): 0

B级 (非常好): 0

C级 (良好): C, C

D级 (一般): 0

E级 (差): 0

编辑:闫晋利 电编:李瑞芳

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