X射线对食管鳞癌细胞HOTAIR, Snail及E-cadherin表达水平影响

摘要

目的: 探索X线诱导食管鳞癌细胞内HOX转录反义RNA(HOX transcript antisense RNA, HOTAIR)及上皮间质化相关因子Snail, E-钙黏蛋白(E-cadherin)表达的时间剂量效应.

方法: 0、2、4、6、8 Gy X射线分别照射食管鳞癌Eca109细胞后, 分别于0、2、4、8、16、24 h提取细胞内总RNA及蛋白, 实时定量PCR检测(real-time quantitative PCR, qRT-PCR)及Western blot检测相应指标mRNA及蛋白的表达水平.

结果: Eca109细胞接受X线照射后继续培养24 h后发现, 随X线照射剂量渐增大(0→2→4→6→8 Gy), HOTAIR与Snail表达水平逐渐升高: HOTAIR mRNA, Snail mRNA在6 Gy与8 Gy照射组表达水平显著高于0 Gy组, Snail蛋白在4 Gy照射组即有显著升高; 而E-cadherin mRNA与其蛋白表达水平逐渐降低, 6 Gy与8 Gy照射组显著低于0 Gy组, 均P<0.01. 细胞接受8 Gy X线照射后, 伴随照射后培养时间延长(0→2→4→8→16→24 h)细胞内HOTAIR, Snail表达水平逐渐升高: 与0 Gy组相比, 细胞培养至第8小时HOTAIR mRNA表达水平显著升高, 培养至第16小时Snail mRNA与其蛋白表达水平显著升高; 而E-cadherin mRNA与其蛋白伴随照射后培养时间延长表达水平逐渐降低, 培养至第8小时E-cadherin与其蛋白表达水平即显著低于0 Gy组(均P<0.01).

结论: X射线诱导HOTAIR, Snail及E-cadherin的异常表达呈时间和剂量依赖性, 三者可能共同参与肿瘤细胞放疗抵抗形成.

关键词: X射线; 食管鳞癌; Eca109; HOTAIR; Snail; E-cadherin

核心提示: 本文以食管鳞癌细胞Eca109为研究对象, 探索X线诱导食管鳞癌内HOX转录反义RNA(HOX transcript antisense RNA, HOTAIR)及上皮间质化相关因子Snail, E-钙黏蛋白(E-cadherin)表达的时间剂量效应. 结果显示X射线诱导上述因子的表达呈时间和剂量依赖性, 三者可能共同参与肿瘤细胞放疗抵抗形成.

Radiation-induced expression of HOTAIR, Snail and E-cadherin in esophageal squamous cell carcinoma cells

Chun-Li Da, Yao Tan, Yi-Yi Zhan, Ya-Wei Li, Kai Liu, Ruo-Zheng Wang

Chun-Li Da, Department of Intensive Care Unit, Tumor Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Yao Tan, Ya-Wei Li, Kai Liu, Department of Radiotherapy for Head and Neck, Tumor Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Yi-Yi Zhan, Department of Lung Cancer Chemotherapy, Tumor Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Ruo-Zheng Wang, Department of Radiotherapy, Tumor Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Supported by: Natural Science Foundation of Xinjiang Uygur Autonomous Region, No. 2015211C115.

Correspondence to: Ruo-Zheng Wang, Professor, Chief Physician, Department of Radiotherapy, Tumor Hospital of Xinjiang Medical University, 789 Suzhou Road, Xinshi District, Urumqi 830000, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China. wrz8526@163.com

Received: December 31, 2015
Revised: January 26, 2016
Accepted: February 2, 2016
Published online: March 18, 2016

Abstract

AIM: To investigate the effect of X-ray radiation on the expression of HOTAIR and epithelial-mesenchymal transition (EMT) related factors in esophageal squamous cell carcinoma (ESCC).

METHODS: Eca109 cells were irradiated with 0, 2, 4, 6, or 8 Gy of X-rays. After 0, 2, 4, 8, 16, or 24 h of radiation, the expression of HOTAIR, Snail and E-cadherin was detected by qRT-PCR and Western blot.

RESULTS: In Eca109 cells irradiated for 24 h, X-ray dose-dependently increased HOTAIR and Snail expression levels but decreased E-cadherin mRNA and protein expression. The mRNA expression levels of HOTAIR and Snail in the 6 Gy and 8 Gy groups were significantly higher than those in the 0 Gy group. Of note, Snail protein level dramatically increased in the 4 Gy group. The expression of E-cadherin mRNA and protein was statistically lower in the 6 Gy and 8 Gy groups compared with the 0 Gy group (P < 0.01). In Eca109 cells irradiated with 8 Gy X-ray, X-ray time-dependently increased the expression of HOTAIR and Snail but decreased E-cadherin mRNA and protein expression. HOTAIR and Snail mRNA and protein expression was significantly higher in the 8 and 16 h groups than in the 0 h group, while the expression of E-cadherin mRNA and protein was gradually decreased in the 8 h group compared with the 0 h group.

CONCLUSION: X-ray induces abnormal expression of HOTAIR, Snail and E-cadherin time- and dose-dependently, which may result in the occurrence of cellular radioresistance.

Key Words: X-ray; Esophageal squamous cell carcinoma; Eca109; HOTAIR; Snail; E-cadherin

0 引言

食管癌是人类8种最常见恶性肿瘤之一, 全世界新增病例约30万/年, 其中约70%发生在我国. 病理类型中食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)占90%以上[1]. ESCC总体预后不佳, 放化疗仍是目前失去手术机会及手术前后的食管癌患者主要的治疗手段. 临床研究发现, 有近70%的肿瘤患者在病情不同阶段需要放射治疗. 然而, 由于肿瘤细胞放射抵抗性的存在限制了放疗杀死肿瘤细胞的能力[2].

长链非编码RNA(long non-coding RNAs, lncRNAs)是一类长度>200 nt且不表现任何蛋白编码潜能的lncRNAs, 目前已成为继miRNAs之后的又一研究热点, 其本身并不编码蛋白, 而是以RNA的形式在多种层面(表观遗传学、转录水平、转录后水平)调控基因表达, 在个体发育、肿瘤发生、侵袭转移过程中发挥重要作用[3,4]. 上皮间质化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是指细胞由上皮表型向间质表型转变的过程, 其重要特征就是上皮标志物丢失, 而间质标志物表达水平升高, 是导致肿瘤发生侵袭转移及放化疗抵抗的重要原因之一[5,6]. lncRNA在肿瘤发生、转移及化疗抵抗中作用的研究使人们开始关注其在放疗抵抗中的作用及其与EMT间的相关性. 本研究对ESCC细胞分别进行不同剂量X线照射, 旨在观察不同剂量X射线照射食管鳞癌细胞Eca109后经不同时间, 细胞内lncRNA HOTAIR及EMT相关因子的时间及剂量效应, 为食管鳞癌的放疗联合靶向治疗提供潜在分子靶点.

1 材料和方法

1.1 材料

ESCC Eca109细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心; 顺铂注射液购自江苏豪森药业股份有限公司; 胎牛血清购自四季青生物制品有限公司; 细胞培养基RPMI 1640购自美国Thermo; 胰蛋白酶购自北京鼎国生物技术有限公司; TaKaRa PrimeScript RT Reagent Kit试剂盒购自大连宝生物有限公司; RNA酶为美国Sigma公司生产; 分光光度计购自美国Thermo; 恒温CO₂培养仪购自美国Thermo Fisher; 逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)仪及实时定量PCR(real-time quantitative PCR, qRT-PCR)仪均购自美国BIORAD; 蛋白提取试剂盒及蛋白定量试剂盒购自Pierce; PVDF膜为millipore; 兔抗人多克隆Snail抗体, 兔抗人多克隆E-cadherin抗体及内参鼠抗人单克隆β-actin抗体均购自美国Santa Cruze公司.

1.2 方法

1.2.1 X射线的照射条件: 将浓度为1×10⁶/mL的细胞以2 mL/孔接种于6孔板, 按照实验设计方案进行分组, 每组设3个复孔, 另设对照孔及调零孔. 将接种好细胞的培养皿放置在培养箱中静置24 h, 待细胞充分贴壁; 细胞贴壁后, 将培养皿置于X线治疗机下进行照射, 分别接受0、2、4、6、8 Gy单次吸收剂量, 剂量率为2 Gy/min, 源皮距为100 cm.

1.2.2 qRT-PCR: 采用TRIzol Reagent法提取细胞内总RNA, 按照TaKaRa PrimeScript RT Reagent Kit试剂盒说明书进行逆转录得到cDNA, 然后进行qRT-PCR过程.

1.2.3 Western blot: 消化并收集细胞, 按照Pierce蛋白提取试剂盒说明书提取细胞总蛋白, BCA法测定蛋白浓度, 经蛋白上样缓冲液变性后, 取20 μL上样, 8%-10%的聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳, 后将蛋白条带转至PVDF膜, 分别用兔抗人多克隆抗体Snail(1:5000), 兔抗人多克隆抗体E-cadherin(1:2000)抗体及内参鼠抗人单克隆抗体β-actin(1:5000)检测上述蛋白的表达水平.

统计学处理 用SPSS17.0统计软件对数据进行统计学分析. 所有数据以mean±SD表示, 数据统计分析采用t检验或单因素方差分析. 细胞抑制率% = (OD对照组-OD实验组-OD空白组)/(OD对照组-OD空白组)×100%. 以细胞抑制率为纵坐标, 放疗剂量为横坐标, 做出抑制率曲线. P<0.05为差异有统计学意义.

2 结果

2.1 不同剂量照射Eca109细胞后24 h, 细胞内HOTAIR及EMT相关因子的表达情况

Eca109细胞接受X线照射后继续培养24 h, 随着X线照射剂量逐渐增大(0→2→4→6→8 Gy), Eca109细胞内HOTAIR mRNA表达水平逐渐增高: 6 Gy与8 Gy照射组HOTAIR表达水平显著高于0 Gy组; 8 Gy照射组HOTAIR表达水平还显著高于2 Gy照射组与4 Gy照射组, 各组间差异有统计学意义(表1, 均P<0.01).

表1 不同剂量X射线照射Eca109后24 h, 细胞HOTAIR及EMT相关因子的表达.

剂量(Gy)	mRNA的表达			蛋白的表达
	HOTAIR	Snail	E-cadherin	Snail	E-cadherin
0	1.00±0.00	1.00±0.00	1.00±0.00	0.027±0.01	0.009±0.00
2	1.17±0.41	1.51±0.60	1.07±0.07	0.054±0.01	0.007±0.00
4	1.49±0.47	1.85±0.36	0.86±0.09c	0.093±0.009bc	0.006±0.00
6	1.68±0.26a	3.63±1.11bc	0.50±0.12bdf	0.102±0.02bd	0.004±0.00bc
8	2.61±0.38bde	5.02±0.78bdf	0.26±0.05bdfg	0.105±0.012bd	0.001±0.00bdfg
P值	0.0018	0.0001	0.0001	0.0001	0.0001

^aP<0.05,

^bP<0.01 vs 0 Gy;

^cP<0.05,

^dP<0.01 vs 2 Gy;

^eP<0.05,

^fP<0.01 vs 4 Gy;

^gP<0.05 vs 6 Gy. HOTAIR: HOX转录反义RNA; EMT: 上皮间质化.

Snail也随X射线照射剂量逐渐增大表达水平逐渐升高: Snail mRNA表达水平在6 Gy与8 Gy照射组细胞内显著高于0 Gy及2 Gy照射组; 8 Gy照射组显著高于4 Gy照射组. Snail蛋白表达水平在4 Gy、6 Gy及8 Gy照射组显著高于0 Gy与2 Gy照射组, 各组间差异有统计学意义(均P<0.01)(图1).

图1 不同剂量X线照射Eca109细胞后24 h, 细胞内EMT相关蛋白表达情况. EMT: 上皮间质化.

E-cadherin随X射线照射剂量逐渐增大表达水平呈下降趋势: E-cadherin mRNA表达水平在6 Gy与8 Gy组显著低于0 Gy、2 Gy及4 Gy照射组; 8 Gy组表达水平还显著低于6 Gy组. E-cadherin蛋白表达水平在6 Gy、8 Gy照射组显著低于0 Gy与2 Gy照射组; 8 Gy照射组也显著低于4 Gy与6 Gy照射组组, 各组间差异有统计学意义(均P<0.01).

2.2 8 Gy X射线照射Eca109细胞后经过不同时间点细胞内HOTAIR及EMT相关因子的表达情况

细胞在接受8 GyX射线照射后, 伴随培养时间延长细胞内HOTAIR mRNA表达水平逐渐增高: 培养至16 h, 细胞内HOTAIR表达水平显著高于0 Gy与照射后2 h组; 培养至24 h, HOTAIR表达水平进一步增高, 并显著高于0 Gy、照射后2、4、8及16 h组, 各组间差异有统计学意义(均P<0.01).

Snail mRNA及其蛋白伴随培养时间延长表达水平逐渐升高: 培养至8 h, Snail mRNA与其蛋白表达水平显著高于0 Gy组和照射后2 h组; 培养至16 h和24 h其表达水平进一步升高, 各组间差异有统计学意义(均P<0.01).

而E-cadherin mRNA及其蛋白表达水平随照射后培养时间延长逐渐降低: 培养至8 h表达水平显著低于0 Gy组和照射后2 h组; 培养至16 h, 24 h其表达水平进一步降低, 并显著低于0 Gy、照射后2 h和4 h组; 另外, 照射后24 h组E-cadherin mRNA表达水平还显著高于8 h培养组(均P<0.01)(表2, 图2).

表2 8 Gy X射线照射Eca109细胞后不同时间点细胞HOTAIR及EMT相关因子的表达.

时间(h)	mRNA的表达			蛋白的表达
	HOTAIR	Snail	E-cadherin	Snail	E-cadherin
0	1.00±0.00	1.00±0.00	1.00±0.00	0.28±0.02	0.04±0.006
2	1.19±0.32	1.51±0.60	1.00±0.15	0.26±0.01	0.04±0.004
4	1.52±0.15	1.85±0.36	0.88±0.23	0.36±0.07	0.03±0.004
8	1.58±0.20	3.74±0.93bc	0.52±0.12ac	0.43±0.06ac	0.02±0.003bd
16	2.06±0.25bd	4.92±0.86bdf	0.28±0.16bdf	0.58±0.06bdf	0.01±0.002bde
24	2.94±0.30bdfhj	6.02±1.04bdfg	0.13±0.07bdfg	0.62±0.07bdfg	0.01±0.007bdf
P值	0.0001	0.0001	0.0001	0.0001	0.0001

^aP<0.05,

^bP<0.01 vs 0 h;

^cP<0.05,

^dP<0.01 vs 2 h;

^eP<0.05,

^fP<0.01 vs 4 h;

^gP<0.05,

^hP<0.01 vs 8 h;

^jP<0.01 vs 16 h. HOTAIR: HOX转录反义RNA; EMT: 上皮间质化.

图2 8 Gy X射线照射Eca109细胞后不同时间点细胞内EMT相关蛋白表达情况. EMT: 上皮间质化.

3 讨论

在恶性肿瘤细胞中, 某些特定的lncRNA的表达水平会发生明显改变, 在肿瘤发生、发展中可能发挥着复杂而广泛的调控作用, 并最终导致肿瘤细胞的恶性增殖, 影响肿瘤患者的病情及后期放化疗效果[4,7-11]. HOTAIR是第一个被发现的通过反式转录调控方式对靶基因进行调控的lncRNA, 其在包括乳腺癌[12]、结直肠癌[13]、肺癌[14]等多种恶性肿瘤中高表达, 并参与肿瘤复发、转移及放化疗抵抗过程[11,15,16]. 另外, 大量的研究已证实, 细胞在由上皮表型向间质表型转变过程中通过诱导上皮标志物E-cadherin、ZO-1等的丢失, 间质标志物Snail、Vimentin表达水平升高促进肿瘤细胞侵袭、转移及放化疗抵抗[5,6]. 高表达的Snail继而通过Wnt/β-catenin[17]、TGF-β1/Snail[18]、Notch/Snail[19]等途径来调节EMT信号转导通路, 在EMT过程中扮演着重要角色.

近年的研究[12,20]发现, 高表达的HOTAIR通过重排基因表达模式, 在表观遗传水平引起EMT进程中关键因子Snail的高表达, 继而参与诱导乳腺及胰腺上皮细胞向胚胎成纤维细胞转化. Xu等[21]通过RNAi技术抑制胃癌AGS细胞系中HOTAIR表达后发现, AGS细胞出现了明显的间质上皮化改变(MET, 即逆转EMT), Western blot研究发现, 细胞间质化表型标志如Vimentin、N-cadherin及Snail、slug、twist表达明显下调, 并以Snail下降最明显, 而上皮化表型标志E-cadherin和ZO-1表达上调. Jiang等[16]体外研究发现, 高表达HOTAIR通过调控Wnt通路抑制因子(wnt inhibitory factor 1, WIF-1)的表达参与胰腺癌细胞(Panc-1, Capan-2)放疗抵抗形成, 后者是Wnt/β-catenin信号转导通路中关键性抑制因子, 通过与Wnt的胞外配体结合阻止该通路下游受体与配体的结合, 保证细胞内β-catenin在较低水平. 另外还发现, 不同剂量X射线(0、2、4、6、8 Gy)照射胰腺癌细胞24 h后qRT-PCR发现, 伴随培养时间延长及照射剂量增加, 细胞内HOTAIR表达水平逐渐升高, 而WIF-1表达水平逐渐降低. 本研究通过不同剂量X线照射Eca109细胞后继续培养24 h后发现, 伴随照射剂量逐渐增高, Eca109细胞内Snail mRNA、Snail蛋白及HOTAIR mRNA表达水平逐渐升高, 而E-cadherin mRNA及相应蛋白表达水平逐渐降低. 另外还发现, 细胞接受8 GyX线照射后伴随培养时间延长, 细胞内HOTAIR mRNA, Snail mRNA与相应蛋白表达水平逐渐升高, 而E-cadherin mRNA及相应蛋白表达水平逐渐降低. 这与Jiang等[16]的研究结果一致. 但Chen等[22]体内研究发现, X射线能抑制HOTAIR及Wnt通路中的β-catenin的核内转移过程, 改善肿瘤细胞的放射敏感性, 出现实验结果相反的原因可能与体内肿瘤细胞在接受放疗后细胞状态不稳定, 而检测HOTAIR过程重复性低有关.

总之, 结合既往文献及本研究结果我们推测, 而X射线呈剂量及时间依赖性诱导Eca109细胞内HOTAIR的高表达, 该诱导作用可能正是肿瘤细胞内EMT相关因子表达异常的原因之一, 最终导致肿瘤细胞放化疗抵抗的产生, 并可能会成为未来预防和治疗恶性肿瘤有效的靶标及患者预后分析的有效指标. 然而, X射线对ESCC细胞内HOTAIR及EMT相关因子影响的具体机制目前仍不清楚, 仍待进一步的体内外研究证实.

评论

背景资料

长链非编码RNA(long non-coding RNAs, lncRNAs)在多种恶性肿瘤中异常表达, HOX转录反义RNA(HOX transcript antisense RNA, HOTAIR)是目前研究的较为透彻的lncRNA, 现在发现其通过调控上皮间质化相关因子(epithelial mesenchymal transition, EMT)的表达参与肿瘤发生, 转移及化疗抵抗, 随着人们对其的深入研究, 人们开始关注其在放疗抵抗中的所扮演的角色, 并有望为肿瘤放疗联合靶向治疗提供潜在分子靶点.

同行评议者

周福有, 教授, 主任医师, 安阳市肿瘤医院胸外科; 王雅棣, 教授, 主任医师, 北京军区总医院放疗科

研发前沿

食管癌总体预后不佳, 临床研究发现, 近70%的患者在病情不同阶段需要放射治疗. 然而, 由于肿瘤细胞放射抵抗性的存在限制了放疗效果. 近年来对lncRNA HOTAIR及EMT相关因子关系的研究结果提示其具有广阔应用前景, 有望在食管癌的早期诊断, 靶向治疗, 预后分析中发挥重要作用.

相关报道

Xu等也通过RNAi技术抑制胃癌AGS细胞系中HOTAIR表达后发现, AGS细胞出现了明显的间质上皮化改变, Western blot研究发现, 细胞间质化表型标志如Vimentin, N-cadherin及Snail, slug, twist表达明显下调, 并以Snail下降最明显, 而上皮化表型标志E-cadherin和ZO-1表达上调.

创新盘点

本文研究结果显示, X射线通过诱导HOTAIR及EMT相关因子异常表达, 参与肿瘤细胞放疗抵抗过程, 该过程呈现时间及剂量依赖性.

应用要点

随着今后对lncRNA HOTAIR与EMT之间调控机制的不断深入研究, 有望为食管癌早诊、治疗及预后分析提供新的思路和研究方向.

名词解释

长链非编码RNA(lncRNAs): 是一类长度大于200 nt且不表现任何蛋白编码潜能的ncRNAs, 起初被认为是RNA聚合酶Ⅱ转录的副产物, 被看为转录的"噪音", 现在发现其以RNA的形式在多种层面调控基因(Snail, E-cadherin等)表达, 在个体发育、肿瘤发生、侵袭转移过程中发挥重要作用.

同行评价

本文通过X线照射食管鳞癌细胞Eca109, 通过体外实验研究X射线对食管鳞癌细胞系内HOTAIR及EMT相关因子的影响, 具有一定的理论意义和潜在的临床价值.

备注

编辑: 于明茜 电编: 闫晋利

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