粪便中钙卫蛋白水平对溃疡性结肠炎患者疾病严重程度和复发的评估价值

摘要

目的: 探讨粪便中钙卫蛋白(calprotectin, CP)水平对溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)的诊断价值、疾病的严重程度以及预后复发的评估作用.

方法: 采集72例活动期UC患者、28例缓解期UC患者和18例健康成人粪便样本, 使用ELISA方法检测粪便中CP水平. 分析其对疾病的诊断, 疾病严重程度, 治疗后疾病缓解, 以及对疾病发生发展的预测价值.

结果: 研究发现活动期UC患者粪便中CP水平(373.2 µg/g±89.8 µg/g)明显高于缓解期UC患者(78.6 µg/g±24.3 µg/g)和健康对照者(46.9 µg/g±15.3 µg/g)(P<0.001), 尤其发现重症UC患者比中度和轻度UC患者粪便中CP明显升高(P<0.01). 进一步分析发现, UC患者粪便中CP水平与Mayo评分和C反应蛋白呈正相关关系(P<0.01). 活动期UC患者经过有效药物治疗后, 粪便中CP水平明显下降(P<0.001), 而病情复发患者粪便中的CP水平再次显著升高(P<0.001).

结论: 我们研究证实了活动期UC患者粪便中CP水平明显升高, 并能够预测UC的疾病活动程度, 判断病情预后和复发, 提示粪便中CP 是一项有效的指标, 用于判断UC疾病发生发展.

关键词: 溃疡性结肠炎; 粪便; 钙卫蛋白; 诊断; 预后

核心提示: 炎症性肠病是消化系统的常见病, 传统的检测指标缺乏特异性, 难于真实反映肠道炎症情况, 钙卫蛋白由肠道中性粒细胞释放, 可做为肠道炎症的特异性标志物, 在炎症性肠病的诊断、炎症活动性、治疗效果评价及疾病复发预测等方面具有极高的价值.

Role of fecal calprotectin in evaluation of disease activity and recurrence of ulcerative colitis

Song-Ting Lin

Song-Ting Lin, Department of Gastroenterology, Haikou People's Hospital, Haikou 570208, Hainan Province, China

Correspondence to: Song-Ting Lin, Associate Chief Physician, Department of Gastroenterology, Haikou People's Hospital, 43 Renmin Avenue, Haidian Island, Haikou 570208, Hainan Province, China. linst9999@126.com

Received: January 5, 2016
Revised: January 13, 2016
Accepted: January 19, 2016
Published online: February 28, 2016

Abstract

AIM: To assess the potential role of calprotectin (CP) in the evaluation of ulcerative colitis (UC) severity and recurrence.

METHODS: Fecal samples were collected from 72 patients with active UC (A-UC), 28 patients with UC in remission (R-UC) and 18 healthy controls. The levels of CP in fecal samples were analyzed by ELISA. The potential role of CP in the evaluation of disease severity, efficacy of clinical treatment and prognosis was investigated.

RESULTS: The levels of fecal CP were markedly increased in patients with A-UC (373.2 µg/g ± 89.8 µg/g) compared with those in R-UC patients (78.6 µg/g ± 24.3 µg/g) and healthy controls (46.9 µg/g ± 15.3 µg/g) (P < 0.001). Fecal CP was found to be significantly increased in severe UC patients compared with that in mild-moderate UC patients (P < 0.01). Fecal CP had a positive correlation with Mayo scores and C-reactive protein in the sera of UC patients (P < 0.01). CP was found to be significantly decreased in UC patients after receiving effective treatment compared with that before treatment (P < 0.001). However, it was observed to be markedly increased in UC patients with disease recurrence (P < 0.001).

CONCLUSION: These data suggest that fecal CP is significantly increased in active UC patients, which can be used to diagnose the disease and predict the disease progression. Therefore, fecal CP is a useful biological marker for the prediction of UC development.

Key Words: Ulcerative colitis; Feces; Calprotectin; Diagnosis; Prognosis

0 引言

炎症性肠病包括克罗恩病和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC), 是发生在肠道慢性非特异性炎症病变. 目前对炎症性肠病的发病原因和发病机制仍不清楚, 研究发现肠道感染、肠黏膜组织内局部免疫应答异常、环境精神应激、基因遗传等因素参与了疾病的发生过程[1]. UC患者的主要临床表现有慢性腹泻、脓血便、腹疼、发热、营养不良等. 在UC患者炎症肠黏膜组织内有大量激活的免疫细胞浸润, 如中性粒细胞、T细胞、B细胞、巨噬细胞、树突状细胞等, 分泌高水平的促炎症细胞因子[1-3], 诱导肠上皮细胞凋亡坏死, 引起隐窝脓肿. 同时炎症肠黏膜组织内中性粒细胞可以释放许多炎症相关的蛋白质[如钙卫蛋白(calprotectin, CP)、乳铁蛋白], 混合于粪便中. 因此, 可以通过粪便测定这些蛋白质, 有可能用于评估肠黏膜炎症状态. CP是中性粒细胞分泌的钙结合蛋白, 主要参与调节炎症反应. 在肠道黏膜炎症损伤发生时, 中性粒细胞从血液循环中迁移到肠黏膜组织内, 然后被释放到肠腔内, 引起粪便中CP升高[4,5]. 本文检测UC患者粪便中CP水平, 旨在分析其对UC的临床诊断, 疾病严重程度, 以及肠黏膜炎症复发的价值.

1 材料与方法

1.1 材料

收集2014-08/2015-12于海南省海口市人民医院消化内科门诊和病房住院的活动期UC患者72例, 男性38例, 女性34例, 年龄23-74岁(平均为54.5岁). 根据Mayo临床评分标准[6], 将患者的疾病严重程度分为: 重度30例, 平均病史3.2 mo±1.3 mo; 中度25例, 平均病史3.5 mo±1.6 mo; 轻度17例, 平均病史3.4 mo±1.1 mo. 其中全结肠型者35例, 左半结肠型者28例, 直肠-乙状结肠型者9例. 患者入组时有22例服用了美沙拉秦片剂(3.0 g/d, 商品名: 莎尔福片, 0.5 g/片, 德国Dr. Falk Pharma GmH公司生产)、16例接受了强的松治疗(0.75 mg/d), 12例接受了美沙拉秦片和强的松片治疗, 所有UC患者均未接受任何抗生素、免疫抑制剂(如硫唑嘌呤、环胞霉素、甲氨蝶呤)以及生物制剂(如英夫利昔单抗)治疗. 同时收集了同期门诊28例缓解期UC患者, 其中男性15例, 女性13例, 年龄24-74岁, 平均为68.3岁, 其中有14例服用美沙拉秦片(剂量2.0 g/d)维持治疗, 预防复发. 所有患者均无其他器官疾病、肠道感染、既往肠道手术、饮酒、服用任何药物[如抗生素、非甾体抗炎药(nonsteroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs)、抗凝血药物、益生菌], 以及孕妇等. UC患者的临床诊断根据临床症状、体征、内镜检查、病理组织学检查, 以及必要的影像学检查等确诊. 另外, 选择18例健康者作对照研究, 其中男性10例, 女8例, 年龄23-69岁, 平均为47.6岁. 所有研究对象均征求同意后进行研究, 并取得医院伦理部门的批准, 所有患者均使用无抗凝试管(广州阳普医疗科技股份有限公司生产)收集静脉血, 使用自动生化分析仪测定血清样本中C-反应蛋白(C-reaction protein, CRP)水平(Beckman; Brea, CA, USA), 粪便CP采用ELISA分析抗体试剂盒[Buhlmann Quantum^® Blue, 购自瑞士Buhlmann Laboratories AG公司(Schonernbuch, Switzerland)]检测.

1.2 方法

1.2.1 粪便和外周血清采集: 收集每1例研究对象的大便(50-100 mg), 置于无菌试管内, 存放于4 ℃待用, 1 wk内测定完毕. 另外, 于晨起使用无抗凝试管收集所有对象空腹静脉血5 mL, 立即离心, 采集血清, 储存-80 ℃待用, 用于常规血清生化检测.

1.2.2 粪便中CP水平分析: 测定CP按照ELISA分析抗体试剂盒的说明书进行, 每个样本重复2次, 按照平均值计算; 测定范围为0-600 µg/g, 下限值(灵敏度)为10 pg/mL. 简要如下, 先将粪便样本与样本提取缓冲液1:50倍稀释, 将样本管放入多孔漩涡混匀器, 充分震荡30 min, 使样本变成匀浆, 将匀浆转移至2 mL离心管内, 用3000 g离心5 min, 提取物再用孵育缓冲液1:50倍稀释, 共稀释250倍. 标准品改为蛋白分析浓度, 分别为10、30、100、300、600 µg/g. 参照说明书, 根据ELISA程序, 将检测板用酶标仪读数(波长450 nm), 制作工作范围10-600 µg/g的标准曲线, 检测结果包含标准品和空白孔在450 nm的吸光度(A), 然后对比计算出检测样本中CP浓度.

1.2.3 粪便中CP水平与疾病的严重程度相关分析: 根据Mayo评分系统[6], 对所有患者进行临床疾病严重程度进行评估, Mayo评分≤2分为缓解, 3-5分为轻度, 6-10分为中度, 11-12分为重度. 分析比较重度、中度、轻度、缓解期UC患者粪便中CP水平, 并与患者外周血CRP水平进行相关分析. 使用自动生化分析仪测定血清样本中CRP水平.

统计学处理 统计分析使用SPSS14.0(SPSS; Chicago, IL, USA)进行. 数据以mean±SD表示, 采用t检验和Spearman's相关分析进行数据分析, 检验水准α = 0.05. P<0.05为差异有统计学意义.

2 结果

2.1 UC患者粪便中CP水平测定

通过检测所有上述对象粪便中CP水平, 结果研究发现活动期UC患者粪便中CP水平明显比缓解UC患者和健康对照者升高(P<0.001), 而缓解期患者与健康者无差异(P>0.05). 另外发现, 活动期UC患者外周血清中的CRP也比缓解期患者和健康者明显升高(P<0.001)(表1).

表1 检测对象粪便中CP和外周血CRP水平 (mean±SD).

检测对象	n	CP(μg/g)	CRP(mg/L)
活动期UC	72	373.2±89.8	46.1±14.2
缓解期UC	28	78.6±24.3b	7.8±3.4b
健康者	18	46.9±15.3b	3.9±1.8b

^bP<0.01 vs 活动期UC. UC: 溃疡性结肠炎; CP: 钙卫蛋白; CRP: C-反应蛋白.

2.2 UC患者粪便中CP水平与疾病严重程度相关性

进一步分析不同疾病严重程度的活动期UC患者CP水平, 发现重度UC患者粪便中CP水平比中度和轻度患者显著增多(418.1 µg/g±94.3 µg/g vs 323.9 µg/g±81.3 µg/g, 238.4 µg/g±65.7 µg/g), 差异有显著意义(P<0.01). 本研究提示测定患者粪便中CP水平可用于判断疾病严重程度.

2.3 UC患者粪便中CP水平与Mayo评分和CRP相关性

我们将活动期UC患者粪便中CP水平与患者的Mayo评分和CRP进行相关分析, 结果发现活动期UC患者粪便中CP水平与患者的Mayo呈正相关关系(r = 0.714, P<0.01), 与血清中CRP水平亦呈正相关关系(r = 0.728, P<0.01). 另外分析发现CP与患者的年龄、性别、发病时间、发病部位以及一些常规实验室指标(如白细胞、血红蛋白、血小板、肝功能和肾功能指标)没有明显相关性(P>0.05).

2.4 UC患者有效治疗后粪便中CP显著降低

对住院治疗的中-重度活动期UC患者给予甲强龙针静脉点滴(40-60 mg/d), qd, 连续10 d; 然后改为口服强的松片(剂量为0.75 mg/kg体质量), 1 wk后开始减量(5 mg/wk). 对于轻度UC患者在门诊给予美沙拉秦片剂, 3 g/d(1.0, tid, po). 治疗1 mo后, 根据Mayo评分评估疾病发展状态. 发现72例患者有51例患者病情缓解(Mayo评分≤2分), 但仍有21例患者仍处于活动期. 收集上述所有患者粪便, 测定粪便中CP水平, 结果发现病情缓解的患者粪便中CP显著降低(治疗前为382.9 µg/g±91.5 µg/g, 治疗后为79.2 µg/g± 21.6 µg/g, P<0.001), 而仍处于活动期的患者粪便中CP水平处于较高的水平(治疗前370.1 µg/g±87.3 µg/g, 治疗后为342.3 µg/g±86.7 µg/g, P>0.05).

2.5 CP对UC病情复发的预测价值

对于UC病情缓解的28例患者, 门诊随访6 mo, 根据患者的临床症状、体征以及18例患者接受了结肠镜检查, 判断是否有肠黏膜炎症复发, 结果发现有9例患者病情复发. 再次收集患者的粪便, 使用ELISA检测CP水平. 结果发现病情复发UC患者粪便中CP水平再次显著升高(复发者为357.3 µg/g±79.8 µg/g, 缓解患者开始时为78.6 µg/g±24.3 µg/g, P<0.001).

3 讨论

当前临床上对UC的临床诊断和鉴别诊断, 主要依赖临床症状、体征、内镜、病理学检查和影像学资料[1]. 但因大多患者有一些临床资料不特异, 致使诊断困难, 尤其是与感染性疾病、肠道免疫性疾病、功能性疾病等相鉴别. 内镜检查结合病理学检查是确诊的重要手段, 但因内镜检查存在有创性和高风险因素(穿孔、出血、麻醉意外等), 致使许多患者不易接受, 同时也不能随意复查和实时监控, 给临床上开展带来许多不便.

近年来有许多血清和粪便标志物应用于临床, 如CRP、核周型抗中性粒细胞胞质抗体和抗酿酒酵母抗体、乳铁蛋白、髓过氧化物酶、蛋白酶3、溶菌酶等, 但因肠黏膜炎症的不同部位, 疾病的不同临床状态, 服用的药物, 以及是否合并肠道感染等可能均影响着这些指标的变化, 致使这些指标不能准确地预测疾病的发展状态[7]. 因此, 当前临床上急需简便易测可靠的生物学指标, 用于对炎症性肠病的诊断和疾病预后的评估.

近来研究报道, CP是中性粒细胞分泌的36 kDa的钙结合蛋白, 占中性粒细胞胞浆蛋白的60%, 主要参与调节组织器官内的炎症反应[7,8]. CP在粪便中非常稳定, 不易被肠道细菌降解, 室温下可在大便中稳定存在7 d左右[9], 因此, CP可以作为一种非创伤性生物学标志物, 用于对肠黏膜炎症损伤的诊断[4,5]. 有研究表明炎症性肠病患者的CP水平远高于其他肠道疾病患者. 国外研究[10]显示其在UC活动期患者粪便中的含量大幅度上升. 因此, CP在炎症性肠病的诊断、预测复发、治疗效果方面受到医学家们的广泛关注[11]. 既往已有临床研究发现CP在炎症性肠病患者粪便中比肠易激综合征患者和健康者显著升高, 通过ROC曲线分析发现粪便中CP水平比CRP和红细胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate, ESR)更准确地判断肠黏膜炎症程度, 用于对炎症性肠病患者与肠易激综合征的鉴别诊断[12]. 另外也有报道发现, 粪便中CP水平升高可增加克罗恩病患者2倍的复发风险, 以及UC患者14倍的复发风险, 说明检测粪便中CP水平可用于预测炎症性肠病的病情复发[13,14]. 另外也有研究[15]证实CP可能预测患者的肠黏膜炎症愈合程度. 我们研究发现在国人活动期UC患者粪便中CP显著升高, 与疾病严重程度密切相关, 与患者的Mayo评分和CRP呈正相关关系, UC患者有效治疗后粪便中CP显著降低, 并能够预测病情的复发. 我们的研究结果与国外研究接近, 提示粪便中CP水平是一项重要的生化指标, 用于UC的临床诊断, 并判断病情复发. 因此, 根据我们的研究结果, 提示粪便中CP水平是一种可靠敏感的生化标志物, 用于临床诊断UC, 帮助临床医生对UC疾病发展过程进行临床评估, 为疾病的诊治提供一个重要的客观指标. 但我们也要认识到, CP作为监测肠道炎症的一项指标, 其检测值在临床上也会受一些药物如非甾体类抗炎药及质子泵抑制剂等的影响[16], 糖皮质激素是否对CP有影响目前尚未见报道. 同时因CP对UC的诊断、鉴别诊断及病情评估较为敏感, 还可以作为治疗的评估手段, 因此常规治疗不影响其在UC中的检测, 但仍需要我们不断研究及改进.

评论

背景资料

研究发现钙卫蛋白(calprotectin, CP)是中性粒细胞分泌的一种钙结合蛋白, 参与了炎症性肠病的疾病发生发展过程. 本课题重点探讨粪便中CP在溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)患者表达及其与疾病严重程度和复发的关系.

同行评议者

阴赪宏, 研究员, 首都医科大学附属北京友谊医院感染与急救医学

研发前沿

已有研究报道发现一些血清和粪便中的生化标志物用于炎症性肠病的临床诊断和疾病严重程度的评估, 粪便中CP可用于炎症性肠病的临床诊断. 本文研究国人UC患者粪便中CP水平, 为临床诊断和疾病评估提供理论依据.

相关报道

既往报道CP在活动克罗恩病和UC患者粪便中升高, 与疾病的预后有密切关系.

创新盘点

本文分析发现活动期UC患者粪便中CP水平升高, 病情越重, 粪便中CP升高越明显. 粪便中CP水平与疾病发生发展有密切关系.

应用要点

粪便中CP水平可用于活动期UC患者的临床诊断, 并能作为疾病预后的可靠生化指标.

同行评价

本研究探讨了粪便中CP水平对UC的诊断价值、疾病的严重程度以及预后复发的评估作用, 结果表明粪便中CP水平能够预测UC的疾病活动程度, 判断病情预后和复发, 具有较好的创新性.

备注

编辑:郭鹏 电编:闫晋利

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