紫草素对刀豆蛋白A诱导的急性肝损伤的作用及初步机制

摘要

目的

探索紫草素对刀豆蛋白A(concanavalin A, Con A)诱导的急性肝损伤的保护作用及其可能机制.

方法

通过尾静脉注射Con A建立急性肝损伤模型. 小鼠随机分为正常组、肝损伤模型组、紫草素低剂量组(12.5 mg/kg)、紫草素中剂量组(25 mg/kg)、紫草素高剂量组(50 mg/kg), 共计5个分组. 检测不同分组之间的谷丙转氨酶(alanine transaminase, ALT)、谷草转氨酶(aspartate transaminase, AST)水平; HE染色比较不同分组之间的病理改变; 一氧化氮检测试剂盒检测不同分组之间的一氧化氮水平; Western blot测定一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)、核因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)、IκBα和IκBβ的表达.

结果

与正常组相比, 模型组中血清中的ALT和AST水平显著升高(P<0.05); 模型组肝组织坏死明显, 坏死率差异具有统计学意义; 模型组肝组织中NO的合成增多(P<0.05); 模型组肝组织中iNOS和NF-κB表达增多, IκBα和IκBβ的表达减少. 与模型组相比, 紫草素(50 mg/kg)显著降低小鼠血清中的ALT和AST水平, 并减少肝细胞坏死率; 同时减少iNOS和NF-κB表达, IκBα和IκBβ的表达则增多. 低剂量组(12.5 mg/kg)和中剂量组(25 mg/kg)与模型组比较无统计学差异.

结论

紫草素(50 mg/kg)可以显著改善Con A诱导的急性肝损伤, 且可能是通过抑制NF-κB信号通路激活, 进而减少NO合成来实现的.

关键词: 紫草素; 肝损伤; 一氧化氮; NF-κB

核心提要: 紫草素可能是通过抑制核因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)信号通路激活, 进而减少一氧化氮合酶表达和一氧化氮合成来改善刀豆蛋白A(concanavalin A, Con A)诱导的急性肝损伤.

Effect of shikonin on concanavalin A-induced liver injury and possible mechanisms involved

Miao Shen

Miao Shen, Department of Gastroenterology, Zhejiang Provincial People's Hospital, Hangzhou 310014, Zhejiang Province, China

Correspondence to: Miao Shen, Department of Gastroenterology, Zhejiang Provincial People's Hospital, 158 Shangtang Road, Xiacheng District, Hangzhou 310014, Zhejiang Province, China. sm19871104@163.com

Received: July 3, 2016
Revised: July 28, 2016
Accepted: August 7, 2016
Published online: September 8, 2016

Abstract

AIM

To investigate the effect of shikonin on concanavalin A (Con A)-induced acute liver injury in mice and explore the underlying mechanisms.

METHODS

Acute liver injury was induced by Con A in Balb/c mice through tail injection. The mice were randomly divided into five groups of fourteen mice as follows: (1) normal group; (2) Con A-induced model group; (3) low-dose (12.5 mg/kg) shikonin + Con A group; (4) medium-dose (25 mg/kg) shikonin + Con A group; (5) high-dose (50 mg/kg) shikonin + Con A group. Histological grading and the measurement of the levels of alanine transaminase (ALT), aspartate transaminase (AST), nitric oxide (NO), inducible nitric oxide synthase (iNOS), nuclear factor-κB (NF-κB), IκBα and IκBβ were performed.

RESULTS

Compared to the normal group, the histological grade as well as the levels of ALT, AST, NO, iNOS and NF-κB significantly increased in the model group, but the levels of IκBα and IκBβ were decreased. After shikonin (50 mg/kg) treatment, the histological grade and the levels of ALT, AST, NO, iNOS and NF-κB significantly were decreased, and the levels of IκBα and IκBβ were increased. The doses of 12.5 mg/kg and 25 mg/kg worked inefficiently.

CONCLUSION

Shikonin (50 mg/kg) protects against Con A-induced liver injury by decreasing the level of NO, which may correlate with the amelioration of NF-κB activity.

Key Words: Shikonin; Liver injury; NO; Nuclear factor-κB

0 引言

急性肝损伤可以由各种原因导致, 包括药物, 病毒, 酒精, 高脂饮食和射线等等. 目前来说, 肝脏疾病仍然是一个全球性的问题, 因急性肝损伤所引起的死亡率仍然较高[1,2]. 因此, 迫切需要寻求更多的药物来改善各种原因引起的肝损伤. 同时在发病机制方面, 大量研究表明, 多种炎症因子和调控通路在急性肝损伤的进展中起着重要的角色, 如白介素(interleukin, IL)-1, IL-2, IL-6, 一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)分子和核因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)信号通路等[3-7]. 紫草素, 提取于紫草, 是一种脂溶性很强的萘醌类色素, 分子式为C₁₆H₁₆O₅, 具有多种特性, 包括抗、抗氧化、抗肿瘤、抗细菌和组织修复等[8,9]. 近几年来, 紫草素的抗炎效果在多种炎症动物模型中被证实, 同时其可能的抗炎机制也通过体外模型逐步被发现[10-13]. 这些动物模型包括有关节炎、胰腺炎、急性肺损伤和脑缺血再灌注损伤等, 比如在2009年, Dai等[14]发现紫草素可以改善自身免疫性关节炎. 内毒素所诱导的急性肺损伤可以被紫草素改善, 这一作用也在2013年被科学家证实[15]. 同样的, 也有研究指出紫草素可以通过抑制NF-κB途径来改善雨蛙素所诱导的急性胰腺炎[16]. 总而言之, 紫草素的抗炎作用被越来越多的人所熟知, 但其在急性肝损伤中的作用及相关机制尚未有报道. 本实验主要针对不同浓度紫草素对刀豆蛋白A(concanavalin A, Con A)诱导的急性肝损伤的作用及可能机制进行研究.

1 材料和方法

1.1 材料

♂Balb/c小鼠(6-8 wk, 20-21 g)均购自上海斯莱克动物实验有限公司(上海, 中国). 自由饮食, 饲养环境温度控制在25 ℃. 12 h光照周期. 紫草素(纯度>95%)和Con A购自Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, United States). 紫草素和Con A均被保存在4 ℃. 小鼠天冬氨酸氨基转移酶(aspartate transaminase, AST)ELISA试剂盒、小鼠谷丙转氨酶(alanine transaminase, ALT)ELISA试剂盒和一氧化氮检测试剂盒均购自上海江莱生物科技有限公司. 相关抗体包括NF-κB、IκBα、IκBβ、iNOS和β-actin均购自Cell Signaling Technology Inc.(Beverly, MA, United States).

1.2 方法

1.2.1 动物处理: 小鼠随机分为以下5组, 每组14只. 分组如下, 第1组: 正常组(saline组); 第2组: Con A模型组; 第3组: 紫草素(12.5 mg/kg)+Con A组; 第4组: 紫草素(25 mg/kg)+Con A组; 第5组: 紫草素(50 mg/kg)+Con A组. 实验前2 wk开始将紫草素溶解在花生油中, 设定3个剂量浓度, 分别为12.5、25和50 mg/kg, 通过灌胃的方式预保护小鼠, 每天1次. 正常组和Con A模型组给予同等剂量花生油灌胃. 灌服14 d结束后1 h除正常对照组外各组小鼠均尾静脉注射Con A溶液, 剂量为20 mg/kg, 正常对照组小鼠尾静脉注射同剂量生理盐水. 小鼠分别在Con A注射后3和6 h后进行去眼球采血, 静置2 h后, 3000 r/min, 离心15 min, 取血清保存于-20 ℃冰箱中, 以备测定ALT、AST; 各组小鼠均处死并取肝左叶以液氮速冻后保存于-80 ℃冰箱中, 以备NF-κB、IκB-α、IκB-β和iNOS检测. 取肝右叶置于40 g/L多聚甲醛4 ℃下固定, 用于HE染色.

1.2.2 生化分析: 取小鼠血清, 按试剂盒说明测定血清中AST、ALT含量. NO的测定也按照试剂盒说明书进行操作, 简言之, 精确称取肝组织100 g, 提取总蛋白, 定蛋白含量后, 测定NO水平, 并以每个样品蛋白含量进行含量校正.

1.2.3 病理学检测: 小鼠肝脏组织分离得到后在40 g/L甲醛中固定24 h. 完成的组织蜡块用切片机切成5 μm厚的切片. 切片经HE染色后在光镜下观察. 其中坏死区域面积用Image-pro Plus6.0软件进行定量分析.

1.2.4 Western blot分析: 将储存在-80 ℃的肝组织解冻, 使用蛋白提取试剂盒获得总蛋白. 通过BCA法检测蛋白浓度, 将不同分组间等量的蛋白量加入胶孔内, 经浓缩胶和分离胶分离后, 转膜至PVDF膜上. 转膜完毕后, 非结合位点用5%牛奶进行封闭1 h, 后用相应抗体孵育过夜, 浓度分别为NF-κB(1:500), IκBα(1:500), IκBβ(1:500)和iNOS(1:500). 在第2天, 所有膜用PBST清洗3次, 每次5 min. 洗毕后, 所有膜用PBST清洗3次, 然后用对应二抗孵育1 h. 洗去二抗后, 予曝光. 用凝胶成像分析系统对NF-κB、IκBα、IκBβ和iNOS蛋白条带与相应得内参造β-actin条带进行灰度扫描, 以两者扫描强度比值作为各目标蛋白的相对表达量.

统计学处理 实验数据利用SPSS17.0软件分析. 实验结果均以mean±SD表示. 各组间比较采用方差分析, P<0.05差异有统计学意义.

2 结果

2.1 紫草素对Con A诱导急性肝损伤的影响

如表1, 图1所显示, 在3 h和6 h两个时间点上, 模型组的ALT和AST水平较正常组明显升高, 表明Con A诱导的急性肝损伤模型建立成功. 同时, 我们发现在紫草素(50 mg/kg)处理分组中, 两个时间点的ALT和AST水平较模型组有明显下降(P<0.05), 但在12.5 mg/kg和25 mg/kg两个分组中则不明显. 其次我们通过HE染色的方式比较不同分组的病理表现, 如图2. 我们发现在正常组中, 肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列, 细胞界限清晰, 细胞核明显, 结构正常. 在模型组中, 肝细胞肿胀明显并且散乱分布, 存在大量炎性细胞浸润, 小叶中可见大面积片状坏死. 而在紫草素(50 mg/kg)处理组中, 这些表现明显改善, 坏死面积较正常组显著减少, 具有统计学意义. 但在12.5 mg/kg和25 mg/kg两个分组中, 该差异无统计学意义(图3).

表1 紫草素对小鼠血清ALT和AST水平的影响 (n = 7, mean±SD, U/mL).

分组	ALT	AST
3 h
正常组	161.33±12.33	120.35±11.21
Con A模型组	1143.67±65.11	1040.65±125.31
Con A+紫草素(12.5 mg/kg)	1114.67±92.17	948.86±116.76
Con A+紫草素(25 mg/kg)	1296.25±89.63	902.17±210.16
Con A+紫草素(50 mg/kg)	299.54±15.63	299.84±19.10
6 h
正常组	123.58±11.21	119.44±10.56
Con A模型组	1900.33±186.31	1753.36±226.33
Con A+紫草素(12.5 mg/kg)	1848.13±251.41	1738.24±211.77
Con A+紫草素(25 mg/kg)	1870.53±200.56	1618.21±209.98
Con A+紫草素(50 mg/kg)	928.11±126.37	820.11±190.19

ALT: 谷丙转氨酶; AST: 谷草转氨酶; ConA: 刀豆蛋白A.

图1 紫草素对不同分组血清中ALT和AST的作用. A: 紫草素对ALT的作用; B: 紫草素对AST的作用. ^aP<0.05 vs Saline+Con A. ALT: 谷丙转氨酶; AST: 谷草转氨酶.

图2 紫草素对不同分组的病理变化影响(×200).

图3 紫草素对不同分组肝组织坏死率的影响. A: 3 h肝组织坏死率; B: 6 h肝组织坏死率. ^aP<0.05 vs Saline+Con A.

2.2 紫草素对小鼠肝组织中iNOS表达和NO合成的影响

我们发现在模型组中, NO的水平较正常组明显上升, 具有统计学意义. 但在两个低剂量紫草素组中, NO水平无明显改变(图4). 同样的, 我们用Western bolt的方法检测iNOS在肝组织中的表达, 发现经紫草素(50 mg/kg)后, 肝组织中的iNOS水平被明显下调, 具有统计学差异, 两个低剂量组则不明显(图5, 6).

图4 紫草素对不同分组NO水平的影响. ^aP<0.05 vs Saline+Con A.

图5 紫草素对不同分组iNOS, NF-κB, IκBα和IκBβ表达的影响. 1: Saline; 2: Saline+Con A; 3: Con A+Shikonin. iNOS: 一氧化氮合酶; NF-κB: 核因子-κB.

图6 不同分组iNOS, NF-κB, IκBα和IκBβ与β-actin比值之间的比较. A: iNOS与β-actin的比值; B: NF-κB与β-actin的比值; C: IκBα与β-actin的比值; D: IκBβ与β-actin的比值. ^aP<0.05 vs Saline+Con A.

2.3 紫草素对NF-κB信号通路的影响

我们发现在模型组中NF-κB的表达显著上升, IκBα和IκBβ的表达则受到抑制, 表明NF-κB通路在模型组中被激活. 通过紫草素(50 mg/kg)干预后, 发现NF-κB的表达较模型组有下降低, IκBα和IκBβ的表达则增多, 表明NF-κB信号通路被抑制, 差异具有统计学意义. 低剂量组无统计学意义(图5, 6).

3 讨论

作为一种传统中草药紫草的提取物, 紫草素具有抗炎活性. 其抗炎活性已在多种疾病模型中得到证实[17,18], 但其在Con A诱导的急性肝损伤疾病模型中的作用尚未被报道. 本实验中, 通过检测不同分组中血清ALT和AST水平及观察病理改变, 发现紫草素(50 mg/kg)可以显著降低ALT和AST水平, 同时减少肝细胞坏死比例, 由此可见, 紫草素可以有效地改善Con A诱导的急性肝损伤.

NO是一个多功能分子, 在炎症性损伤中起着重要作用[19-22]. 正常情况下, 肝脏仅由结构型NOS即eNOS诱导产生低水平NO, 作为肝脏微循环功能调节的重要信使; 但是, 在氧化应激状态下, 诱生型NOS即iNOS激活, 持续大量的NO被合成、释放, 具有显著肝细胞毒作用, 是使肝细胞产生氧化应激的关键分子之一, 是多种类型肝损伤炎症、感染发生、发展过程的重要促进和效应因子[23-25]. 近来, Koerber等[26]通过Con A来诱导急性肝损伤, 发现敲除iNOS基因的小鼠相较于正常小鼠有显著好转. 同时, 多种药物或者复合物已被证实可以通过这条途径来改善急性肝损伤, 比如甘草苷和水飞蓟宾[27]. 可见, 通过抑制一氧化氮的合成或许是改善Con A诱导的急性肝损伤的一条重要途径. 因此, 我们设想紫草素作为一种抗炎药物, 是否可以通过抑制iNOS表达, 从而减少NO合成, 达到改善肝损伤的作用. 在本实验中, 如前文所述结果, Con A诱导的肝损伤模型中, 小鼠肝脏iNOS水平和NO合成较正常小鼠明显上升, 但经紫草素后, iNOS水平和NO合成均有所下降, 初步证实了我们的设想.

那么紫草素是如何调控iNOS的表达的呢? 大量研究表明, NF-κB信号通路在各种原因造成的肝损伤中起着重要的作用. 他通过对多种炎症因子转录的调节而参与肝损伤的发生、发展. 有学者研究证明, NF-κB活化可引起TNF-α、iNOS和内皮素的生成增加, 并认为这在Con A引发肝损伤的动态发展过程中起着重要的作用[26,28,29]. 本实验中, 我们设想紫草素是否可以抑制iNOS上游调控通路即NF-κB信号通路来调控iNOS的表达. 结果表明, NF-κB信号通路中的相关蛋白即IκBα和IκBβ经紫草素处理后, 两者的表达较模型组均有所上升, 表明其对NF-κB分子的降解作用被增强, 使NF-κB分子表达降低, 从而NF-κB信号通路被抑制.

总之, 本实验中我们证实紫草素(50 mg/kg)对Con A诱导的急性肝损伤有明显的保肝降酶作用, 且可能是通过抑制NF-κB信号通路激活, 进而降低iNOS表达, 减少NO合成来实现的.

评论

背景资料

紫草素, 提取于紫草, 是一种脂溶性很强的萘醌类色素, 具有多种特性, 包括抗、抗氧化、抗肿瘤、抗细菌和组织修复等. 近几年来, 紫草素的抗炎效果在多种炎症动物模型中被证实, 但其在急性肝损伤中的作用及相关机制尚未有报道. 本实验主要针对不同浓度紫草素对刀豆蛋白A(concanavalin A, Con A)诱导的急性肝损伤的作用及可能机制进行研究.

同行评议者

沈世强, 教授, 武汉大学人民医院普外科; 苏松, 副教授, 四川医科大学附属医院肝胆外科; 王晓鹏, 副主任医师, 甘肃省人民医院普外科; 张卓, 副教授, 沈阳医学院公共卫生学院营养与食品卫生学教研室

研发前沿

一氧化氮是急性肝损伤发生发展过程中的重要损伤因子. 一氧化氮的合成取决于一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)的调控和表达. 同时, 在急性肝损伤的炎症反应中, 核因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)通路起着重要作用, 调控多种炎症因子, 如白介素(interleukin, IL)-2, IL-6, iNOS等的表达.

相关报道

有报道指出, 在Con A诱导的急性肝损伤模型中, NF-κB信号通路可以调控HMGB1的合成和释放, 进一步调控自噬的发生发展, 这一机制同样在该疾病模型中起着重要作用.

创新盘点

本实验首次证明紫草素可以通过抑制NF-κB信号通路激活, 使iNOS表达和NO合成减少, 从而改善Con A诱导的急性肝损伤.

应用要点

本文为临床上应用紫草素治疗急性肝损伤提供了一定的实验基础, 探讨紫草素改善急性肝损伤的作用机制, 为后续研究提供了方向.

名词解释

NF-κB信号通路: 在细胞因子诱导的基因表达中起关键性的调控作用, 他调控的基因编码急性期反应蛋白、细胞因子、细胞黏附因子、免疫调节分子、病毒瘤基因、生长因子、转录和生长调控因子等. 通过调控多种基因的表达, NF-κB参与免疫反应、炎症反应、细胞凋亡、肿瘤发生等多种生物进程.

同行评价

本文以NF-κB信号通路中的分子表达水平为切入点, 从病理学和生化分析的角度, 研究了紫草素对Con-A诱导的小鼠急性肝损伤的保护作用. 本研究内容较为新颖, 具有较好的科研性和参考价值.

备注

手稿来源: 自由投稿

学科分类: 胃肠病学和肝病学

手稿来源地: 浙江省

同行评议报告分类

A级 (优秀): 0

B级 (非常好): 0

C级 (良好): C, C

D级 (一般): D, D

E级 (差): 0

编辑:于明茜 电编:李瑞芳

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