大黄素对人胃癌细胞株SGC-7901凋亡的影响与初步机制

摘要

目的: 探讨大黄素诱导人胃癌细胞株SGC-7901凋亡及其相关机制.

方法: 采用CCK-8法和Tunel染色法检测不同浓度大黄素处理后, SGC-7901细胞凋亡的变化; 免疫印迹法检测Bcl-2、Bax、cleaved-Caspase3、cleaved-PARP、preCaspase3、PARP的蛋白表达水平; JC-1染色荧光显微观察线粒体膜电位的变化.

结果: CCK-8法和Tunel染色法显示大黄素呈浓度依赖性促进SGC-7901细胞的凋亡(存活率100.73%±8.97% vs 45.27%±3.75%, P<0.05); 免疫印迹法显示给予60 μmol/L大黄素处理后, 与空白对照组相比, 细胞中Bcl-2的蛋白表达显著降低(0.31±0.02 vs 1.01±0.06, P<0.05), 而Bax的表达显著增加(1.98±0.12 vs 1.00±0.08, P<0.05), 导致Bcl-2/Bax比值显著降低(0.14±0.01 vs 1.02±0.13, P<0.05); 再者, JC-1染色显示线粒体膜电位降低; 活性的cleaved-Caspase3(1.73±0.13 vs 0.98±0.06, P<0.05)、cleaved-PARP(2.29±0.17 vs 1.01±0.08, P<0.05)表达增加.

结论: 大黄素呈浓度依赖性促进SGC-7901细胞的凋亡, 其作用机制可能与线粒体途径凋亡有关.

关键词: 大黄素; 人胃癌细胞株SGC-7901; 凋亡; 线粒体

核心提示: 大黄素主要是通过上调促凋亡蛋白Bax的表达, 同时下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达, 改变线粒体膜电位, 激活了内源性线粒体通路, 激活Caspase3, 从而激活一系列凋亡级联因子, 促进细胞的凋亡, 进而促进胃癌细胞的凋亡.

Effect of emodin on apoptosis in human stomach cancer cell line SGC-7901 and possible mechanisms involved

Chen-Gao Ma

Chen-Gao Ma, the 2^nd Clinical College of Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, Zhejiang Province, China

Correspondence to: Chen-Gao Ma, the 2^nd Clinical College of Zhejiang Chinese Medical University, 548 Binwen Road, Binjiang District, Hangzhou 310053, Zhejiang Province, China. machengao@126.com

Received: April 17, 2016
Revised: May 6, 2016
Accepted: May 9, 2016
Published online: June 8, 2016

Abstract

AIM: To investigate the effect of emodin on cell apoptosis in human stomach cancer cell line SGC-7901 and to explore the related mechanisms.

METHODS: After SGC-7901 cells were treated with different concentrations of Emodin, cell apoptosis was determined by CCK-8 assay and TUNEL assay. The expression of Bcl-2, Bax, cleaved-Caspase3, cleaved-PARP, preCaspase3, and PARP was measured by Western blot. Mitochondrial membrane potential was examined by JC-1 staining and fluorescence microscopy.

RESULTS: The apoptotic rate of SGC-7901 cells was increased by emodin in a dose-dependent manner (survival rate 100.73% ± 8.97% vs 45.27% ± 3.75%, P < 0.05). Compared with the control group, treatment with emodin (60 μmol/L) significantly increased Bax expression (1.98 ± 0.12 vs 1.00 ± 0.08, P < 0.05), Caspase3 (1.73 ± 0.13 vs 0.98 ± 0.06, P < 0.05) and PARP (2.29 ± 0.17 vs 1.01 ± 0.08, P < 0.05) activation, while decreased Bcl-2 expression (0.31 ± 0.02 vs 1.01 ± 0.06, P < 0.05), Bcl-2/Bax ratio (0.14 ± 0.01 vs 1.02 ± 0.13, P < 0.05) and mitochondrial membrane potential.

CONCLUSION: Emodin accelerates the apoptosis of SGC-7901 cells via the mitochondria-dependent pathway. Our results reveal a novel role for emodin in the treatment of gastric cancer.

Key Words: Emodin; SGC-7901 cells; Apoptosis; Mitochondria

0 引言

胃癌的发生率在我国高发性消化系肿瘤中占第1位, 且呈逐年上升的趋势. 胃癌的诱因众多, 发病机制非常复杂[1]. 研究[1,2]表明, 机体在正常状态下, 胃黏膜上皮细胞的增殖和凋亡之间保持在一定的动态平衡, 这种动态平常通常是由癌基因和抑癌基因的调控. 胃癌的发病机制主要是由于动态平衡的打破. 诱导肿瘤细胞凋亡是抗癌药物治疗肿瘤的重要机制之一, Bcl-2家族基因是哺乳动物细胞中调节凋亡最重要的调控基因之一, 对肿瘤的发生发展发挥中大的作用[3-5]. 报道[6]指出柠檬酸钠通过调控促凋亡蛋白Bax、抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xl的表达, 从而激活内源性线粒体通路, 诱导胃癌细胞的凋亡.

大黄素属于蒽醌类衍生物, 是药用植物大黄的主要药用成分单体, 具有抑菌、抗炎、改善微循环、免疫调节和抗癌等多种药理作用[7-12]. 目前大黄素的应用主要集中于食管癌, 肺癌和胰腺癌等[4-6], 对胃癌的研究机制尚未深入, 本实验主要针对不同浓度大黄素对胃癌细胞株SGC-7901凋亡的影响及其可能的作用机制进行研究.

1 材料和方法

1.1 材料

人胃癌细胞株SGC-7901购自上海细胞所; 大黄素购自山西森弗生物有限公司, 纯度>98.0%; 胎牛血清, RPMI 1640培养基购自Gibco公司; CCK-8试剂盒购自碧云天生物技术有限公司; 线粒体分离试剂盒购自Thermo Fisher Scientific公司; Tunel染色试剂盒购自Roche公司; Bcl-2、Bax、cleaved-Caspase3、cleaved-PARP、preCaspase3、PARP抗体购自Santa Cruz公司, β-actin抗体均购自Cell Signaling Technology公司; 其余试剂均为国产分析纯.

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与分组: 将SGC-7901细胞株培养于含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中, 于37 ℃、50 mL/L CO₂恒温培养箱中孵育, 每天换液1次. 将大黄素溶于DMSO中, 使浓度分别为15、30、60和120 μmol/L. 设空白对照组, 细胞不给药处理; 溶剂对照组, 细胞中加入等体积的DMSO; 不同浓度(15、30、60和120 μmol/L)的大黄素溶液处理组.

1.2.2 CCK-8法检测细胞存活率: 对处于对数期生长的SGC-7901细胞制成细胞悬液, 接种于48孔板中, 加入无血清培养液继续培养24 h. 加药后将各组细胞放于37 ℃、50 mL/L CO₂培养箱中孵育48 h后, 加入CCK-8溶液, 继续培养4-5 h, 采用酶联免疫检测仪450 nm处测量吸光度值, 实验重复3次.

1.2.3 Tunel染色法检测细胞凋亡: 将各组细胞调节为5×10⁶个/mL的单细胞悬液, 4%多聚甲醛固定, PBS洗涤, 细胞通透液4 ℃通透2 min, PBS洗涤2次, 加入Tunel反应液(TdT+荧光素标记dUTP), 并于37 ℃湿盒中避光孵育60 min, 洗涤, 加入DAPI, 封片. 荧光显微镜下以484 nm激发波长、535 nm发射波长观察绿色荧光凋亡细胞.

1.2.4 线粒体提取: 采用线粒体分离试剂盒并根据产品说明书提取细胞中的线粒体, 用10 mL冰预冷的PBS轻轻重悬细胞沉淀, 加入冰预冷试剂A, 匀浆10 s, 于4 ℃, 800 r/min离心5 min, 加入冰预冷试剂B, 800 r/min离心3 min, 冰上孵育4 min, 其中每隔1 min涡旋震荡1次, 加入冰预冷试剂C, 4 ℃, 800 r/min离心5 min. 沉淀为线粒体部分. 取上清液, 4 ℃, 10000 r/min离心5 min, 为胞浆部分.

1.2.5 免疫印迹法检测相关蛋白: 细胞给药培养48 h后, 弃去培养液, PBS洗涤2次, 提取少量细胞蛋白定量, 调整蛋白量. 取适量裂解产物, 进行SDS-PAGE电泳分离, 完成电泳后将蛋白转移至PVDF膜上, 脱脂牛奶封闭1 h, 加入一抗孵育过夜, TBST洗涤3次; 加入相应二抗室温孵育1 h, TBST洗涤3次; 进行荧光显色.

1.2.6 线粒体跨膜电位检测: 线粒体跨膜电位检测按照跨膜电位检测试剂盒说明书操作. 采用JC-1荧光染料指示剂检测线粒体膜电位的改变, 于在荧光显微镜下观察绿色荧光强度(激发波长: 485 nm; 发射波长: 535 nm)与红色荧光强度(激发波长: 550 nm; 发射波长: 600 nm)的比值, 实验重复3次.

统计学处理 应用SPSS15.0软件进行数据处理, 各组实验结果均以mean±SD表示, 组间比较采用单因素方差分析进行统计学处理, 以P<0.05为差异有统计学意义.

2 结果

2.1 大黄素对SGC-7901细胞存活率的影响

实验结果显示大黄素诱导SGC-7901细胞凋亡, 随着其浓度的增大, 细胞存活率降低, 呈浓度依赖关系. 与空白对照组相比, 差异具有统计学意义(P<0.05), 空白对照组和溶剂对照组间无统计学差异. 60 μmol/L和120 μmol/L的大黄素对细胞存活率的影响作用相近, 两组间无统计学差异(图1).

图1 不同浓度大黄素对细胞存活率的影响(n = 6). 1: 空白对照组; 2: 溶剂对照组; 3: 15 μmol/L大黄溶液处理组; 4: 30 μmol/L大黄溶液处理组; 5: 60 μmol/L大黄溶液处理组; 6: 120 μmol/L大黄溶液处理组. ^aP<0.05 vs 空白对照组.

2.2 Tunel染色法检测细胞凋亡

与空白对照组相比, 给予15 μmol/L大黄素培养后的SGC-7901细胞已显示绿色荧光, 且随着浓度的增大而荧光愈发强烈, 提示大黄素呈浓度依赖性诱导SGC-7901细胞凋亡; 空白对照组与溶剂对照组相比无统计学差异(P>0.05). 同样, 60 μmol/L和120 μmol/L的大黄素对细胞凋亡的作用相近, 两组间无统计学差异. 故后续实验采用60 μmol/L的大黄素(图2).

图2 Tunel染色法检测大黄素对SGC-7901细胞凋亡的影响. A: 空白对照组(无绿色荧光)(×100); B: 溶剂对照组(无绿色荧光)(×100); C: 15 μmol/L大黄溶液处理组(有明显绿色荧光)(×100); D: 30 μmol/L大黄溶液处理组(有强烈绿色荧光)(×100); E: 60 μmol/L大黄溶液处理组(×100); F: 120 μmol/L大黄溶液处理组(有强绿色荧光)(×100); G: 相对荧光强度. 1: 空白对照组; 2: 溶剂对照组; 3: 15 μmol/L大黄溶液处理组; 4: 30 μmol/L大黄溶液处理组; 5: 60 μmol/L大黄溶液处理组; 6: 120 μmol/L大黄溶液处理组. ^aP<0.05 vs 空白对照组.

2.3 免疫印迹法检测Bcl-2和Bax蛋白表达的变化

结果显示, 与空白对照组相比, 给予60 μmol/L大黄素培养的SGC-7901细胞中Bax的蛋白表达明显增加, Bcl-2的蛋白表达明显减少, 导致Bcl-2/Bax比值显著减少, 具有统计学意义(P<0.05), 空白对照组与溶剂对照组相比无统计学差异(P>0.05)(图3).

图3 Bcl-2和Bax蛋白表达水平. A: 蛋白条带; B: 蛋白相对表达量. 1: 空白对照组; 2: 溶剂对照组; 3: 60 μmol/L大黄溶液处理组. ^aP<0.05 vs 空白对照组.

2.4 线粒体膜电位变化

如图4所示, 荧光显微镜下显示空白对照组主要显示红色荧光, 给予60 μmol/L大黄素培养后细胞的绿色荧光增强, 红色荧光减弱, 从而导致绿色荧光与红色荧光比值显著增加, 与空白对照组相比具有统计学差异(P<0.05), 空白对照组与溶剂对照组相比无统计学差异(P>0.05).

图4 线粒体膜电位变化. A: 各组荧光表达情况(×200); B: 荧光相对表达量. 1: 空白对照组; 2: 溶剂对照组; 3: 60 μmol/L大黄溶液处理组. ^aP<0.05 vs 空白对照组.

2.5 大黄素对活性的Caspase3与PARP的影响

免疫印迹法结果显示, 与空白对照组相比, 给予60 μmol/L大黄素培养后, SGC-7901细胞中活性的cleaved-Caspase3、PARP表达增加, 而preCaspase3、PARP表达减少, 从而增加了cleaved-Caspase3/preCaspase3、cleaved-PARP/PARP比值, 由1.02±0.05上升至2.41±0.17, 与空白对照组相比具有统计学差异(P<0.05), 而空白对照组与溶剂对照组相比无统计学差异(P>0.05)(图5).

图5 PARP与Caspase3蛋白表达水平. A: 蛋白条带; B: Caspase3相对表达量; C: PARP相对表达量. 1: 空白对照组; 2: 溶剂对照组; 3: 60 μmol/L大黄溶液处理组. ^aP<0.05 vs 空白对照组.

3 讨论

细胞凋亡与肿瘤的发生是密切相关的[13-15], 有研究[16-20]表明肿瘤的发生可能是由于细胞凋亡的通路受阻而产生. 已有研究[21]表明大黄素通过诱导细胞凋亡的途径可抑制人卵巢癌细胞增殖, 刘岸等[22]研究发现大黄素同样以诱导细胞凋亡方式抑制人胰腺癌Panc-1细胞的增殖. 本实验发现CCK-8法测定不同浓度大黄素培养24 h后, SGC-7901细胞的存活率随大黄素浓度的增加而降低, 提示大黄素具有诱导SGC-7901细胞凋亡的作用. 此外, Tunel染色结果显示给药后细胞绿色荧光增强, 再次证明了大黄素对SGC-7901细胞的凋亡具有促进作用. 由于60 μmol/L和120 μmol/L的大黄素对细胞的凋亡作用效果没有显著差异, 推测是由于大黄素到达了溶解的最大值, 故后续试验采用60 μmol/L进行下一步研究.

Bcl-2家族由抗凋亡蛋白(Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-w)和促凋亡蛋白(Bax、Bak、Bim等)组成, 共同构成一个紧密相互作用的控制细胞凋亡的网络, 是细胞凋亡内源性线粒体途径的重要调节因子[23-27]. Caspase3是Bcl-2的下游调控蛋白, 同时作为引起凋亡的始发因子, 近年研究表明, PARP是Caspase3的底物, Caspase3激活后, 改变构象, 然后与活化子结合而被激活形剪切体cleaved-Caspase3, 同时剪切PARP, 使总PARP减少, cleaved-PARP增加, 导致其失去正常功能, 最终使得核小体间DNA降解, 细胞发生凋亡性死亡[28-30]. 本研究结果发现大黄素处理后细胞Bax呈高表达, Bcl-2呈低表达; 还发现Caspase3剪切体呈高表达的同时PARP剪切体也成呈高表达, 二者具有显著正相关性, 而未被激活的Caspase3、PARP均显著减少, 提示大黄素处理后的胃癌细胞中, Caspase3激活可灭活PARP的活性, 使PARP丧失功能, 导致内源性核酸酶活化, 形成DNA片段化, 加速细胞凋亡, 可抑制癌症的恶化. 总之, 推测大黄素主要是通过上调促凋亡蛋白Bax的表达, 同时下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达, 改变线粒体膜电位, 激活了内源性线粒体通路, 激活Caspase3, 从而激活一系列凋亡级联因子, 促进细胞的凋亡, 进而促进胃癌细胞的凋亡. 本实验为大黄素临床上用于治疗胃癌提供了一定的实验基础.

评论

背景资料

大黄素(Emodin, EMO)属于蒽醌类衍生物, 是药用植物大黄的主要药用成分单体, 具有抑菌、抗炎、改善微循环、免疫调节和抗癌等多种药理作用.大黄素的应用主要集中于食管癌, 肺癌和胰腺癌等的治疗, 对胃癌的研究机制尚未深入. 本文首次深入探讨大黄素诱导人胃癌细胞株SGC-7901凋亡及其相关机制.

同行评议者

沈克平, 主任医师, 上海中医药大学附属龙华医院

研发前沿

细胞凋亡内源性线粒体途径的重要调节因子主要有Bax、Bcl-2, 及其下游一系列凋亡级联因子Caspase3、Caspase9以及PARP等, 是细胞凋亡的主要热点通路之一.

相关报道

有报道指出柠檬酸钠通过调控促凋亡蛋白Bax、抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xl的表达, 从而激活内源性线粒体通路, 诱导胃癌细胞的凋亡. 但并没有进一步深入研究下游凋亡级联因子的变化.

创新盘点

本文首次研究大黄素通过改变线粒体膜电位, 激活内源性线粒体通路, 促进胃癌细胞的凋亡, 为大黄素临床上用于治疗胃癌提供了一定的实验基础.

应用要点

为大黄素临床上用于治疗胃癌提供了一定的实验基础, 探讨大黄素促进胃癌细胞凋亡的作用机制, 为后续研究提供了方向.

名词解释

线粒体凋亡途径: 是细胞凋亡的主要途径之一, 是目前研究凋亡的热点. 各种凋亡刺激信号通过BH3(Bcl-2 homology domain 3)-only蛋白引起Bax(Bcl-2-asslciated protein X)蛋白移位到线粒体 外膜并多聚化, 形成膜通道,刺激线粒体释放细胞色素C(Cyt C)和Smac(second mitochondrial-derived activator of caspase), Cyt C通过Apaf-1因子的多聚化与Caspases9形成凋亡小体, 导致下游胱天蛋白酶的级联反应. 而凋亡蛋白抑制因子和Smac通过抑制和促进胱天蛋白酶的级联反应来调控细胞凋亡.

同行评价

本文观察不同浓度大黄素对人胃癌细胞株SGC-7901凋亡的作用, 并较深入地研究了其作用机制, 对胃癌的治疗研究具有较重要的意义.

备注

编辑:郭鹏 电编:闫晋利

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