修回日期: 2015-11-27
接受日期: 2015-12-08
在线出版日期: 2015-12-28
目的: 探讨细胞分裂周期蛋白25同源蛋白C(cell division cycle 25 C, CDC25C)抗体在肝病患者血清中出现的情况及临床意义.
方法: 选取经病理诊断证实的肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)患者血清61例、肝硬化患者血清45例、病毒性乙型肝炎患者血清61例和正常人血清61例, 通过酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)方法, 对上述血清进行CDC25C抗体定量检测, 并运用统计学方法分析和探讨CDC25C在肝病发展中的作用.
结果: ELISA显示HCC患者血清中的CDC25C抗体的阳性率显著高于肝硬化患者血清、病毒性乙型肝炎患者血清和正常人血清(P<0.05). 经两两比较, 正常人血清组中的CDC25C抗体阳性率均低于其他组(P<0.05), 而在肝硬化患者组和病毒性乙型肝炎患者组之间没有显著性差异(P>0.05). 结合临床参数指标分析, 发现CDC25C抗体的阳性率与HCC患者的年龄、性别、黄疸程度及谷丙转氨酶(alanine aminotransferase, ALT)值无关(P>0.05), 但与血清白蛋白降低相关(P<0.05).
结论: CDC25C可能参与了肝病的发生和发展, 有望成为HCC诊断和预后监测的重要指标.
核心提示: 本文对肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)患者、病毒性肝炎患者、肝硬化患者和正常人血清中细胞分裂周期蛋白25同源蛋白C(cell division cycle 25 C, CDC25C)抗体的含量进行检测和分析, 以探讨CDC25C抗体在不同肝病患者中出现的情况及临床意义, 为HCC的诊断和预后监测提供实验室数据.
引文著录: 张琪惠, 李春梅, 黄天明, 陈芳, 罗彬, 赵飞兰, 莫发荣. CDC25C抗体在肝病患者中的血清学检测. 世界华人消化杂志 2015; 23(36): 5848-5853
Revised: November 27, 2015
Accepted: December 8, 2015
Published online: December 28, 2015
AIM: To detect serum antibody against cell division cycle 25 C (CDC25C) in human liver diseases and to evaluate its clinical significance.
METHODS: Serum samples were obtained from 61 hepatocellular carcinoma (HCC) patients, 45 liver cirrhosis patients, 61 hepatitis B patients and 61 normal people. Serum antibody to CDC25C was tested by ELISA and the role of CDC25C in liver diseases was analyzed.
RESULTS: The positive rate of serum anti-CDC25C antibody in HCC was significantly higher than those in liver cirrhosis, hepatitis B patients and normal people (P < 0.05). The positive rate of serum anti-CDC25C antibody in normal people was significantly lower than those in other groups (P < 0.05), but the difference between liver cirrhosis patients and hepatitis B patients did not reach statistical significance (P > 0.05). Although serum anti-CDC25C antibody in HCC was not significantly associated with age, sex, degree of jaundice or alanine aminotransferase (ALT) (P > 0.05), the positive rate of anti-CDC25C antibody had a significant correlation with decreased serum albumin (P < 0.05).
CONCLUSION: CDC25C is associated with progression of liver diseases, and it may be an important indicator for the diagnosis and prognosis monitoring of HCC.
- Citation: Zhang QH, Li CM, Huang TM, Chen F, Luo B, Zhao FL, Mo FR. Serological analysis of anti-CDC25C antibody in human liver diseases. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2015; 23(36): 5848-5853
- URL: https://www.wjgnet.com/1009-3079/full/v23/i36/5848.htm
- DOI: https://dx.doi.org/10.11569/wcjd.v23.i36.5848
原发性肝癌是消化系最常见的恶性肿瘤之一, 肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)在原发性肝癌中占大多数. 从全球来看, 他的高发病率地区位于亚洲东南部、非洲大部等地区[1]. 其临床特点是, 进展迅速, 肝内转移率高, 易复发, 严重威胁到人群的健康及生命. HCC的发生发展是一个受多因素影响的多步骤的复杂过程, 其发生与发展的分子生物学机制尚未阐明. 细胞分裂周期蛋白25同源蛋白C(cell division cycle 25 C, CDC25C)是一种细胞分裂周期蛋白, 目前研究[2,3]已表明, CDC25C参与了多种癌症的调控过程, 我们推测CDC25C可能与肝病的发生发展密切相关. 本实验的研究目的是通过酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测HCC患者、肝硬化患者、病毒性乙型肝炎患者及正常人血清中的CDC25C抗体, 探讨CDC25C在肝病发生、发展中的出现情况及临床意义.
收集2014-05/2014-10广西中医药大学第一附属医院, HCC患者血清61例, 及肝硬化患者血清45例、病毒性乙型肝炎患者血清61例、正常人血清61例. 61例HCC标本收取前均通过病理诊断证实, 并且未经过抗癌治疗. 其中, 性别: 男性52例, 女性9例. 年龄: 24例患者≤50岁, 27例患者>50岁. 黄疸: 28例患者黄疸阳性, 33例患者黄疸阴性. ALT: 33例患者ALT≥35 U/L(正常值), 28例患者<40 U/L. 标本采集后低温运输, 最后贮存于-80 ℃冰箱备用. 该研究获得广西医科大学和广西中医药大学第一附属医院批准, 并且所有患者均已签署知情同意书. 试剂: CDC25C蛋白(本实验室基因重组表达[4]); CDC25C抗体(英国Abcam公司, 阳性对照); 不含CDC25C抗体的山羊血清(阴性对照); 经ELISA法与阴性对照、阳性对照比较, 鉴定为CDC25C抗体阳性和CDC25C抗体阴性的血清各1份; ELISA试剂盒(联众生物技术有限公司批号: 4BK4141115); Souther biotech兔抗人单克隆抗体(批号: K4712-T113B). 仪器: PHOMO型酶标仪(上海雷勃分析仪器有限公司生产).
1.2.1 CDC25C抗原包被浓度以及血清稀释度的确定: 以纯化的CDC25C蛋白作为诊断抗原, 用包被液(0.05 mol/L碳酸盐缓冲液, pH 9.6)将抗原分别稀释至4、6、8、10 µg/mL, 包被酶标板每孔100 µL, 4 ℃过夜. 将CDC25C抗体阳性血清和CDC25C抗体阴性血清用血清用PBST(0.01 mmol/L, 含0.05%Tween20的PBS, pH 7.4)分别稀释至1:100、1:250、1:500, 组成方阵, 根据P/N值(阳性血清A值/阴性血清A值)确定最佳浓度.
1.2.2 血清反应时间的确定: 在确定最佳血清稀释度和抗原包被浓度的基础上, 37 ℃下分别反应1、2、3、4 h, 分析P/N值, 确定最佳反应时间.
1.2.3 样本检测: 采用上述实验所得的最佳条件, 其他条件(如: 封闭液种类, 封闭时间, 显色时间等)依据联众ELISA试剂盒规定, 操作严格遵守试剂盒说明书要求. 实验中的阳性对照为英国Abcam公司CDC25C抗体(浓度为0.84 µg/mL), 阴性对照为不含CDC25C抗体的山羊血清, 实验的最终结果通过PHOMO型酶标仪读取.
统计学处理 利用SPSS16.0软件, 采用χ2检验的方法, 对不同分组中CDC25C抗体的阳性率进行比较, P<0.05表明两组之间的差异有统计学意义.
分析结果显示血清最佳稀释度为1:250, 抗原的最佳包被浓度为6 µg/mL, 此时A450 nm接近1.0, 且P/N值最大(表1). 在反应时间为2 h时A450 nm与1.0最接近, 故血清反应时间可确定为2 h(表2).
| 血清稀释度 | CDC25C蛋白包被浓度(μg/mL) | |||
| 4 | 6 | 8 | 10 | |
| P(1:100) | 1.104 | 1.297 | 1.401 | 1.493 |
| N(1:100) | 0.381 | 0.392 | 0.483 | 0.507 |
| P/N | 2.898 | 3.308 | 2.900 | 2.944 |
| P(1:250) | 0.862 | 1.094 | 1.251 | 1.355 |
| N(1:250) | 0.284 | 0.310 | 0.370 | 0.410 |
| P/N | 3.035 | 3.529 | 3.381 | 3.304 |
| P(1:500) | 0.566 | 0.775 | 0.865 | 0.879 |
| N(1:500) | 0.147 | 0.267 | 0.317 | 0.241 |
| P/N | 3.850 | 2.902 | 2.728 | 3.647 |
| 项目 | 1 h | 2 h | 3 h | 4 h |
| P | 1.005 | 0.972 | 0.933 | 0.867 |
| N | 0.471 | 0.406 | 0.379 | 0.304 |
| P/N | 2.133 | 2.394 | 2.461 | 2.824 |
阳性阈值为0.198 µg/mL. 结果显示HCC组患者血清中的CDC25C抗体的阳性率(85.2%)显著高于其他3组(P<0.05). 经两两比较, 正常人血清组中的CDC25C抗体阳性率均低于其他组(P<0.05), 而在肝硬化患者组和病毒性乙型肝炎患者组之间没有显著性差异(P>0.05)(表3).
| 分组 | n | 阳性(n) | 阴性(n) | 阳性率(%) | P值 |
| HCC患者血清 | 61 | 52 | 9 | 85.2 | |
| 病毒性乙型肝炎患者血清 | 45 | 50 | 11 | 81.9 | <0.05 |
| 肝硬化患者血清 | 61 | 35 | 10 | 77.8 | |
| 正常人血清 | 61 | 35 | 26 | 57.3 |
CDC25C抗体在HCC患者血清中的阳性率(阳性阈值为0.198 µg/mL)与患者年龄、性别、黄疸程度、ALT的表达水平无关(P>0.05), 与血清白蛋白的降低情况相关(P<0.05)(表4).
| 病理特征 | n | 阳性(n) | 阴性(n) | 阳性率(%) | P值 |
| 年龄(岁) | >0.05 | ||||
| ≤50 | 24 | 17 | 7 | 62.5 | |
| >50 | 37 | 33 | 4 | 89.1 | |
| 性别 | >0.05 | ||||
| 男 | 52 | 42 | 8 | 80.7 | |
| 女 | 9 | 9 | 0 | 100.0 | |
| 黄疸 | >0.05 | ||||
| 有 | 33 | 32 | 1 | 96.9 | |
| 无 | 28 | 24 | 4 | 85.7 | |
| ALT(U/L) | >0.05 | ||||
| ≤35 | 26 | 22 | 4 | 84.6 | |
| >35 | 35 | 30 | 5 | 85.7 | |
| 血清白蛋白(g/L) | <0.05 | ||||
| ≤35 | 28 | 20 | 8 | 71.4 | |
| >35 | 33 | 32 | 1 | 96.9 |
HCC是世界范围内常见的消化系肿瘤, 尽管乙型肝炎、丙型肝炎疫苗已在临床上应用, 但其发病率仍不断升高, 并且预后极差. HCC的发生演化涉及抑癌基因、癌基因、DNA的损伤与修复、DNA突变以及表观遗传的改变, 是受多基因控制的多阶段过程. 目前, HCC的治疗主要以手术切除为主, 在有临床手术禁忌证的HCC患者中, 化学治疗和局部治疗有助于提高患者的生存率[5]. HCC的早期诊断、治疗和预后监测对提高患者的生存率有重大意义, 因此寻找能准确评估HCC生物学行为的肿瘤标志物是十分必要的.
CDC25是一种双特异性磷酸酶, 主要通过周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinases, CDK)发挥生物学效应[6]. CDC25C可以在细胞分裂过程中的不同阶段激活cyclin/CDK复合物, 在细胞周期的调控过程中起到非常重要的作用[7]. CDC25C有多个磷酸化位点, 在磷酸化位点发生磷酸化的同时, 可使CDC2/cyclin B复合物去磷酸化, 从而激活CDC2/cyclin B复合物, 使细胞分裂周期由G2期过渡到M期[8]. CDC25C的主要磷酸化位点是丝氨酸216(S216), 在G2/M过渡期, 若出现DNA复制受损, CDC25C的S216位点将会发生磷酸化并与高度保守和广泛表达的14-3-3蛋白家庭结合. S216的磷酸化及CDC25C与14-3-3蛋白的结合可负向调控CDC25C的作用活性, 从而使细胞有丝分裂滞留在G2/M期, 防止了基因突变的发生[9]. 在DNA损伤应答时, CHK1就是通过磷酸化CDC25C的S216调控细胞周期进程的[10]. 通过阻断细胞有丝分裂G2期的抗癌想法来源于对细胞周期的研究, 研究结果表明很多癌症细胞在有丝分裂过程中伴随G1监测点的缺陷, 这导致了G2监测点的依赖性. DNA损伤时, 大多数的传导信号通过CDC25C影响G2监测点, 因此CDC25C可能是癌症靶向治疗的潜在靶位点[11]. Zhao等[12]推测LW-213在乳腺癌中发挥抗癌作用是通过作用于CDC25C从而阻断乳腺癌细胞有丝分裂的G2/M期. Huang等[13]在研究二氢杨梅素(dihydromyricetin, DHM)的抗肿瘤作用机制过程中发现, DHM抑制HCC细胞的生长是通过Chk1/CDC25C相关途径诱导G2/M期细胞周期阻断. 这些均说明了CDC25C有望称为肿瘤防治新的靶位点.
众多研究显示CDC25C是一种肿瘤相关抗原. 北京大学医学部免疫系T细胞室快速高通量筛选了一批新的肿瘤相关抗原候选基因, 其中一个基因(GenBank登录号为NM001790)与CDC25C有同源结构, 该基因属于癌睾丸抗原, 在正常组织中局限表达, 而在肿瘤组织中高水平表达[14]. 初步的RT-PCR结果显示, CDC25C在膀胱癌、乳腺癌、肝细胞癌和结肠癌中呈现高表达[15]. Chou等[16]检测前列腺癌患者中CDC25C的表达水平, 并与正常的前列腺做比较, 结果显示CDC25C在前列腺癌中的表达水平升高, 提示CDC25C在前列腺癌的发生、演化及预后中起重要作用. Wang等[17]研究表明CDC25C的过表达和S216位点高度磷酸化在女性外阴鳞状细胞癌的发生、发展过程中起着至关重要的作用. 张强等[18]检测了肾透明细胞癌组织和正常组织中CDC25C的表达水平, 结果显示肾透明细胞癌组织中CDC25C的表达水平明显高于正常组织. 这些结果均说明了CDC25C表达水平的变化与肿瘤的发生机制有关. 检测肿瘤患者血清中CDC25C抗体情况, 对肿瘤的诊断、预后判断和监测可能有重要意义.
本研究显示CDC25C抗体在HCC患者血清中的阳性率明显高于其他各组, 在正常人血清中的阳性率显著低于其他各组, 具有统计学意义(P<0.05). 一般情况下, "正常-肝炎-肝硬化-肝癌"是肝癌发生的趋势, 本实验结果阳性率呈现HCC组>病毒性乙型肝炎组>肝硬化组>正常人组, 提示CDC25C上调有可能促进了肝病的发展, 但由于例数有限, 病毒性乙型肝炎组和肝硬化组的血清CDC25C抗体阳性率无明显差异, 可在后续实验中扩充样本量, 做进一步研究. 同时, 血清CDC25C抗体的阳性率与HCC患者的年龄、性别、黄疸程度、ALT表达量无关, 但与血清白蛋白的降低情况相关. 相似地, 亦有文献报道证实血清白蛋白降低与肝病发生发展相关[19]. 总之, 我们推测CDC25C在肝病的发生、发展过程中起了重要作用, 有望成为HCC早期诊断及预后判断的重要标志物.
肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)的发生发展是一个受多因素影响的多步骤的复杂过程, 其发生与发展的分子生物学机制尚未完全阐明. 本实验室前期实验应用基因重组技术成功构建并诱导表达出HCC相关抗原细胞分裂周期蛋白25同源蛋白C(cell division cycle 25 C, CDC25C)的融合蛋白, 为深入研究CDC25C在HCC的发病、诊断和临床免疫治疗中的作用奠定基础.
刘起胜, 副教授, 湖南中医药高等专科学校基础医学部微免病理教研室; 朱争艳, 研究员, 天津市第三中心医院; 吴江锋, 教授, 三峡大学医学院形态学部
分析CDC25C与HCC发生、发展的关系, 探讨CDC25C用于HCC预防、免疫靶向治疗、预后评估、复发预防的可行性.
Chou等检测前列腺癌患者及正常人前列腺组织中CDC25C的表达水平, 结果显示CDC25C在前列腺癌中的表达水平升高, 提示CDC25C在前列腺癌的发生、演化及预后中起重要作用. Wang等研究表明CDC25C的过表达和S216位点高度磷酸化在女性外阴鳞状细胞癌的发生、发展过程中起着至关重要的作用. 张强等检测了肾透明细胞癌组织和正常组织中CDC25C的表达水平, 结果显示肾透明细胞癌组织中CDC25C的表达水平明显高于正常组织. 这些结果均说明了CDC25C表达水平的变化与肿瘤的发生机制有关.
尚未见其他实验室以CDC25C作为肿瘤相关抗原应用于HCC诊断和治疗的报道. 本实验将有助于HCC的早期诊断、治疗和预后评估, 可以为HCC的临床免疫治疗提供理论基础.
本文立意较新颖, 文中研究的问题有一定的现实意义, 阐述的论点较明确, 选用方法科学, 统计学处理恰当, 结果较可靠.
编辑:于明茜 电编:闫晋利
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