肝细胞肝癌诱导分化治疗研究进展

摘要

肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)诱导分化治疗是指在某种诱导分化剂或分化信号诱导下, 通过促进肝癌细胞凋亡和抑制增殖使HCC细胞向成熟肝细胞方向分化, 重建正常表型, 恢复正常生物学功能, 从而达到治愈HCC的目的. 细胞分化的观点认为分化障碍是HCC的一个重要生物学特征, 肝细胞肝癌的发生是由于正常基因功能受控于错误的表达程序所致. HCC的恶性程度很高, 预后极差, 严重危及人类健康, 然而肝细胞肝癌的具体发病机制尚不清楚, 研究HCC细胞的分化特征以及寻找新的诱导分化剂不但能为HCC治疗提供合理的治疗对策, 而且有助于人们对HCC发病机制的认识. 本文从分化诱导剂和分化治疗靶点, 分化相关信号通路和分化相关microRNA 3个方面综述了HCC诱导分化治疗的研究进展, 为HCC的治疗提供依据和线索.

关键词: 肝细胞肝癌; 诱导分化; 肝癌干细胞; MicroRNA

核心提示: 肿瘤干细胞理论的提出为肝细胞肝癌的诱导分化治疗提供了新的理论依据. 寻找高效低毒的诱导分化剂和精确的诱导分化治疗靶点是诱导分化治疗的核心与关键. 分化相关信号通路的异常活化和microRNA的表观遗传学调控参与了肝癌细胞的分化调控.

Advances in differentiation therapy of hepatocellular carcinoma

Ya Luo, Hai Jin, Guo-Rong Wen, Bi-Guang Tuo

Ya Luo, Hai Jin, Guo-Rong Wen, Bi-Guang Tuo, Department of Gastroenterology, Affiliated Hospital of Zunyi Medical College; Digestive Disease Institute of Guizhou Province, Zunyi 563003, Guizhou Province, China

Supported by: National Natural Science Foundation of China, No. 81360311.

Correspondence to: Bi-Guang Tuo, Professor, Chief Physician, Department of Gastroenterology, Affiliated Hospital of Zunyi Medical College; Digestive Disease Institute of Guizhou Province, 149 Dalian Road, Zunyi 563003, Guizhou Province, China. tuobiguang@aliyun.com

Received: August 18, 2015
Revised: September 21, 2015
Accepted: September 25, 2015
Published online: October 18, 2015

Abstract

Hepatocellular carcinoma (HCC) is a malignancy of the digestive system, which shows obvious disorders of differentiation. Currently, its pathogenesis is still elusive. Therefore, to figure out the mechanism of disturbed differentiation in HCC is the key to finding out precise therapeutic targets for differentiation therapy. Differentiation therapy of hepatocellular carcinoma refers to making hepatocellular carcinoma cells differentiate into mature hepatocytes, and rebuilding their normal phenotype and normal biological function through promoting HCC cell apoptosis and inhibiting their proliferation in the presence of specific differentiation-inducing agents or signals. In recent years, increasing research results about HCC differentiation therapy have been reported. This article reviews differentiation-inducing agents or targets, differentiation-related signaling pathways and microRNAs, with an aim to provide some clues for HCC differentiation therapy.

Key Words: Hepatocellular carcinoma; Differentiation therapy; Liver cancer stem cells; MicroRNAs

0 引言

肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是分化异常的恶性异质性肿瘤. 随着肿瘤干细胞理论的提出和证实, 认为肿瘤干细胞是指肿瘤中具有自我更新能力并能产生异质性肿瘤细胞的细胞. 近年来, 大量的研究认为肝癌的发生起源于肝癌干细胞, 然而对于肝癌干细胞的来源目前尚存争议, 一种观点认为肝癌干细胞来源于正常肝干细胞的转化, 这些正常肝干细胞由于基因突变导致自我更新和分化的调节失控; 另一种观点认为来源于去分化的成熟肝细胞. 肝癌干细胞的存在被认为是肝癌发生、转移、进展、复发和耐药的"罪魁祸首"[1]. 肿瘤干细胞理论的提出为肝癌诱导分化治疗提供了新的理论依据. 因此, 同时针对肝癌干细胞和肝癌细胞的诱导分化治疗成为新的HCC诱导分化治疗方向. 全反式维A酸(all-trans retinoic acid, ATAR)治疗急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia, APL)是肿瘤分化治疗的经典范例, 极大的推动了诱导分化治疗相关研究的开展. 然而肝癌等恶性实体瘤的诱导分化治疗效果并不理想, 寻找新的诱导分化剂, 深入了解HCC分化机制成为肝细胞肝癌等实体瘤治疗研究的新方向和热点.

1 分化诱导剂和分化治疗靶点

在正常肝脏发育过程中, 调控分化的转录因子主要有肝细胞核因子(hepatocyte nuclear factor, HNF)4α, HNF1α, HNF1β, C/EBPα和C/EBPβ[2]. HNF4α是肝脏富有的细胞核激素受体家族的转录因子, 位于肝细胞核内, 处于转录因子网络调控上游, 在分化成熟的肝细胞中高表达, 可以和肝脏中近1/3的基因启动子结合, 调控肝细胞分化表型, 维护肝细胞生物学功能. Yin等[3]的研究表明通过AdHNF4α感染HepG2和Hep3B肝癌细胞株可使其在小鼠体内的成瘤性完全丧失. 此外, 上调HNF4α表达可以阻断原代培养肝星状细胞和肝细胞上皮间充质转换(epithelial-mesenchymal transition, EMT)现象, 促使活化肝星状细胞向上皮细胞表型转换, 显著减轻多种模型大鼠肝纤维化[4]. 另外也有研究[5]发现HNF4α和E-cadherin在分化程度较高的Hep3B和Huh-7肝癌细胞株表达较高, 在低分化的SK-Hep-1和Bel-7402肝癌细胞株表达较低, 并且人为的促使SK-Hep-1的HNF4α的表达能引起E-cadherin表达的上调, 最终促进间质上皮转换(mesenchymal-epithelial transition, MET)的发生, 降低了HCC细胞的侵袭性. 也有研究[6]进一步发现HNF4α能同时诱导HCC细胞和肝癌干细胞的分化, 明显减轻肝纤维化, 预防肝癌的发生. Zeng等[7]用携带HNF1α基因的腺病毒(AdHNF1α)转染HCC细胞后能恢复某些正常肝脏基因的表达以及miR-192和miR-194水平, 抑制CD133和上皮细胞黏附分子的表达以及雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR), 同时也能抑制转化生长因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)通路的激活. 抑瘤素M(oncostatin M, OSM)被证实不仅能通过信号转导子和转录激活子3(signal transducer and activator of transcription, STAT3)途径增加肝祖细胞分化程度, 而且能通过OSMR途径诱导EpCAM阳性肝癌干细胞分化, 使G0期肝癌干细胞进入细胞周期从而增加肝癌干细胞对化疗药物5-氟尿嘧啶的敏感性[8]. 另外, Kong等[9]的研究表明OSM能使肝癌细胞株SMMC-7721的细胞周期停滞在G0/G1期, 促进其凋亡, 诱导SMMC-7721向正常肝细胞表型分化. 低浓度的三氧化二砷能降低HCC细胞CD133、CD90和甲胎蛋白(alpha-fetoprotein, AFP)等低分化标志物的表达, 促进HCC细胞重建正常表型, 重新分泌白蛋白和球蛋白, 同时增加HCC细胞对传统化疗药物的敏感性[10]. 25-羟基胆固醇作用于肝癌AH136B腹水细胞能促进该细胞凋亡, 联合应用25-羟基胆固醇和低剂量的肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)具有协调抗癌作用[11]. 聚乙二醇干扰素α不仅具有抗肝炎病毒作用也有阻止肝癌发生的作用, 有研究发现在肝脏慢性损伤的过程中用聚乙二醇干扰素α治疗, 能调控肝细胞凋亡、增殖和分化, 大幅减少肝卵圆细胞的数目[12], 降低肝卵圆细胞转化为肝癌干细胞的可能性[13]. 国内的HCC诱导分化相关研究还涉及一些传统的中草药, 如紫龙金[14]、白杨素[15]、小柴胡汤[16]和苦参碱[17]等.

有研究者发现性别决定基因(sex-determining region of the Y, SRY)和干细胞相关基因Oct4(octamer-binding transcription factor 4)是潜在的分化治疗靶点, SRY在人HCC组织中高表达, 并且SRY能通过OCT4基因启动子上的SRY结合位点直接调控OCT4基因表达从而维持HCC细胞的干细胞特性如自我更新能力、成瘤能力[18]. 另外有研究[19]发现细胞表面趋化因子受体7(chemokine receptor, CXCR7)能活化细胞外信号调节激酶(extracellular regulated protein kinase, ERK)使HNF4α表达受抑制来调控HCC分化, 因此CXCR7-ERK-HNF4α有可能成为HCC分化治疗的另一靶点. Sun等[20]研究发现癌性锚蛋白重复蛋白(Gankyrin, Gen-Bank NM-002814)在HCC中过表达, 过表达的Gankyrin促进了正常肝细胞的去分化, 通过慢病毒转染实验沉默Gankyrin的表达能提高HCC细胞的分化程度, 降低HCC的恶性程度. 研究[21]发现Yin Yang-1(YY1)作为锌指蛋白类转录因子GLI-Kruppel家族成员之一在HCC细胞株中高表达, 并且能直接下调调控肝细胞分化的重要转录因子CCAAT/增强子结合蛋白α(CCAAT/enhancer-binding protein α, sCEBPA)发挥其致癌作用, 然而抑制YY1表达或者恢复CEBPA在HCC细胞中的表达能促使HCC细胞分化, 因此YY1有可能作为另一肝癌分化治疗靶点.

2 HCC分化相关信号通路

2.1 Wnt/β-catenin信号通路

Wnt/β-catenin信号通路是经典的Wnt通路, 在正常组织发育过程中调控细胞的增殖、分化和迁移, 其异常激活在许多肿瘤中被发现, 在HCC中同样存在Wnt/β-catenin信号通路的异常活化[22]. β连锁蛋白(β-catenin)作为转录助激活剂调控靶基因表达发挥作用. 在没有Wnt刺激作用时, 细胞质内的β-catenin与GSK-3p、APC、Axin降解复合体结合, β-catenin被磷酸化, 磷酸化后的β-catenin被泛素化标记后降解, 从而使β-catenin处于基础含量水平. 然而在Wnt刺激作用下, β-catenin磷酸化受抑制, 在细胞质内不断积累增多, 转运至细胞核内, 解除转录因子TCF/LEF与转录阻碍物结合后对靶基因转录抑制作用, 与转录因子TCF/LEF结合形成转录复合物, 激活靶基因转录. EMT是上皮来源的恶性肿瘤细胞获得迁移和侵袭能力的重要生物学过程, 在这个过程中正常上皮细胞受控于错误的程序转化为异常分化表型的间质细胞. 大量的研究表明Wnt/β-catenin信号通路参与了许多肿瘤的EMT过程. 有研究[23]表明, HNF4α和β-catenin通过和T细胞因子4(T cell factor 4, TCF-4)竞争性结合调控Slug和snail基因的转录, 从而在调控肝细胞肝癌发生发展过程中形成双向负反馈环, 相互抑制, 自我增强, 从而决定细胞的分化方向是EMT还是MET. 另一项研究[24]表明, HNF4α通过调控Wnt/β-catenin信号通路调节肠道上皮细胞增殖和分化的平衡. 从上述2项研究可以看出Wnt/β-catenin信号通路的活化在HCC去分化的过程中扮演着重要角色.

2.2 Notch信号通路

Notch信号通路是进化高度保守的信号通路, 广泛存在于多细胞生物体. 他在细胞之间传递信息的过程中起着关键作用, 并且在胚胎发育和干细胞分化演变过程中参与调控细胞的分化发育[25]. 研究[26]发现, 在神经胶质瘤中胞质多聚腺苷酸化成分结合蛋白4(cytoplasmic polyadenylation element-binding protein 4)能下调HES1和SIRT1的表达从而调控神经胶质瘤干细胞的分化, 为神经胶质瘤的诱导分化治疗提供了可能的靶点和新的线索. 另外有研究[27]发现在食管癌和胃癌中存在Notch-ATOH1通路活化, 用Notch通路抑制剂如γ-分泌酶抑制剂可以有效阻断该通路的活化, 从而达到一定的胃肠道肿瘤诱导分化治疗的效果. 然而关于Notch信号通路在HCC中的作用仍然尚存争议. 有2项研究[28,29]表明, Notch1的过表达促进了HCC细胞的细胞周期停滞和凋亡从而抑制HCC细胞的生长. Zhang等[30]研究发现Notch3在HCC患者组织中的表达水平和AFP的表达水平成正相关, 和分化程度成负相关, 并且Notch3能够通过使Wnt/β-catenin信号通路失活从而发挥维持肿瘤细胞干性的作用.

2.3 TGF-β信号通路

TGF-β超家族调控着细胞生长和分化, 其在肝细胞肝癌的发生发展过程中起着双重作用, 一方面在HCC初期可作为肿瘤抑制因子抑制细胞增殖、促进凋亡和分化. 另一方面在HCC晚期失去增殖抑制作用, 刺激血管生成、参与免疫抑制、促进细胞外基质形成, 参与了肿瘤微环境的构建[31]. TGF-β信号通路成员[TGF-βR2、SMAD3、SMAD4、胚肝血影蛋白(embryonic liver fodrin, ELF)]的功能紊乱可能导致肝干细胞的自我更新和分化的调节失控, 最终导致肝癌的形成. ELF是肝干细胞标志物, 在肝癌干细胞中缺失, 导致TGF-β信号通路中断, 使得肝干细胞分化调控过程异常, 出现异常分化表型, 最终转化为肝癌干细胞[32]. 有研究[33]发现, TGF-β靶向作用于糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β, GSK3β)使其失活从而使HNF4α发生转录后修饰丧失了DNA结合活性和肿瘤抑制作用. 骨形态发生蛋白4(bone morphogenetic protein, BMP4)属于TGF-β超家族的一个分支. 有研究者发现, 在小鼠模型中BMP4能诱导结肠癌干细胞分化增加其对化疗药物的敏感性[34]. 此外, Zhang等[35]的研究表明外源性高剂量的BMP4能诱导CD133阳性的PLC/PRF/5和Huh7肝癌细胞株中的肝癌干细胞向正常表型分化.

2.4 Hedgehog信号通路

Hedgehog(Hh)信号通路是进化保守的信号通路, 在胚胎时期调控细胞分化、组织和器官发育起着重要作用. 在正常成人肝组织中Hh信号通路处于失活状态, 然而在HCC中该信号通路处于异常激活状态. Hh信号通路包含了7个主要组件, 分别是Hedgehog(Hh)、patched(PTCH)、smoothened(Smo)、GLIs、kinesin-like protein costal 2(Cos 2)、fused(Fu)和suppressor of fused(SuFu). Fu等[36]的研究发现Hh信号通路的配体PTCH的表达在分化程度高的肝细胞癌组织中表达率高, 在分化程度低的肝细胞癌组织中表达率低. 细胞分化的过程常常伴随着细胞增殖与细胞凋亡, 细胞凋亡可以说是细胞的终末分化. Zhang等[37,38]研究发现沉默Gli2基因的表达能进一步下调凋亡抑制蛋白c-FLIP和Bcl-2基因的表达, 从而增加肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体[tumor necrosis factor (TNF)-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL]诱导的凋亡. Xu等[39]研究发现Gli1在肝癌组织中高表达, 并且其表达程度和肝癌的临床病理特征和分化程度密切相关. Zheng等[40]研究发现Gli1能直接上调TGF-β1通路靶基因snail的表达, 从而促进了HCC细胞EMT这一生物学过程的发生和肝癌细胞分化表型的改变.

3 MicroRNA

MicroRNA(miRNA)是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码双链RNA分子, 他们在动植物中参与转录后基因表达调控. 大多数miRNA基因以单拷贝、多拷贝或基因簇的形式存在于基因组中. 成熟的miRNA和RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex, RISC)结合对靶基因mRNA发挥裂解或遏制作用. miRNA表达模式具有分化的位相性和时序性, 因此miRNAs在细胞分化这一生物学过程中发挥着重要的调控作用并且和肿瘤的发生发展密切相关. 研究[41]表明, 在化学致癌物质的作用下, 鼠肝卵圆细胞(hepatic oval cells, HOCs)转分化为HCC细胞, 有研究者检测了1210个miRNA在这个过程中表达的变化, 并且用相关软件预测了表达变化大的miRNA作用的靶基因, 发现这些基因的功能涉及血管生成, 转录后蛋白修饰, 小分子代谢等. Yin等[42]的研究表明, HNF4α能通过上调来源于miR-379-656簇的miR-134水平来逆转HCC的分化表型. miR-148a在肝细胞成熟过程中发挥着重要作用, 他可以直接调控DNA甲基转移酶1基因(DNA methyltransferase, DNMT1)的转录后表达促进HCC细胞向正常肝细胞特有表型分化, 如白蛋白的分泌[43]. 此外也有研究[44]表明, 促使具有高侵袭性的MHCC97H和MHCC97L肝癌细胞株过表达miR-148a能阻断EMT过程, 减弱肝癌干细胞标志物CD90和CD24的表达. 在HCC中, Lin28B的表达越高肿瘤分期越高, 分化程度越低[45]. 在正常发育过程中, RNA结合蛋白Lin28在干细胞中高表达使let-7 miRNA前体成熟受阻从而维持干细胞的自我更新能力. 然而当干细胞启动分化程序时, Lin28表达逐渐降低, 成熟的let-7表达逐渐增加, 干细胞的自我更新能力受抑制从而沿着终末分化方向分化. Lin28/let-7的平衡在细胞分化和肿瘤发生的过程中扮演着方向盘的作用, 这种平衡一旦失衡能导致肝干细胞的恶性转化[46]. 长期慢性的炎症刺激能导致正常细胞的恶性转化, 核因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)、Lin28B、let-7和白介素(interleukin, IL)-6形成的正反馈环作为表观遗传学开关参与了正常细胞表型的转换[47]. miR-181家族成员在上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule, EpCAM)阳性和AFP阳性的HCC细胞中呈高水平表达, miR-181能直接作用于调控分化的肝细胞转录因子, 因此, 抑制miR-181的表达能诱导HCC细胞的分化和抑制HCC细胞的成瘤能力[48]. miR-122来源于hcr基因转录本, 在肝细胞中特异性高表达, 参与调节肝细胞分化代谢, 发挥一定的抗炎抗癌作用[49]. Gα12在HCC中过表达, 加速了HNF4α的泛素化降解, 减弱了HNF4α对miR-122的反式激活作用, 引起了癌基因c-Met表达的增加和ERK、STAT3和Akt/mTOR信号通路的激活[50].

4 结论

从细胞分化的观点分析肝细胞肝癌, 认为分化障碍是HCC细胞的一个重要生物学特性. 大量证据表明, HCC细胞可能起源于一些未分化或微分化的干细胞, 是由于组织更新或损伤修复所产生的分化异常所致. 也有证据表明, HCC细胞来源于正常肝细胞的去分化. 同时越来越多的研究表明, 高效低毒的诱导分化剂能诱导某些肿瘤细胞走向正常的终末分化, 然而针对HCC等恶性实体瘤的诱导分化治疗效果并不理想, 是由于对HCC细胞分化和去分化机制的认识以及不能找到明确的诱导分化靶点. 因此, 从分化相关信号通路, miRNA的表观遗传学调控, 分化相关重要转录因子等多方面充分了解HCC分化异常机制, 有助于找到明确的分化治疗靶点和高效低毒的分化诱导剂, 为HCC提供合理的治疗对策.

评论

背景资料

全反式维A酸治疗急性早幼粒细胞白血病是肿瘤分化治疗的经典范例, 极大地推动了诱导分化治疗相关研究的开展. 然而肝癌等恶性实体瘤的诱导分化治疗效果并不理想.

同行评议者

邓庆, 副研究员, 上海人类基因组研究中心功能基因组部; 任宁, 主任医师, 复旦大学附属中山医院

研发前沿

肝细胞核因子(hepatocyte nuclear factor, HNF)4α作为调控肝脏分化的重要转录因子, 在肝细胞肝癌的诱导分化治疗过程中具有一定的诱导分化作用已经有大量的研究证实, 然而肝细胞肝癌诱导分化治疗仍未取得突破性进展, 是因为缺乏对肝细胞肝癌分化机制的认识. 因此, 寻找新的诱导分化剂, 深入了解肝细胞肝癌分化机制成为肝细胞肝癌等实体瘤治疗研究的新方向和热点.

相关报道

HNF4α和β-catenin通过和T细胞因子4竞争性结合调控Slug和snail基因的转录, 从而在调控肝细胞肝癌发生发展过程中形成双向负反馈环, 相互抑制, 自我增强, 从而决定细胞的分化方向是上皮间充质转换(epithelial-mesenchymal transition, EMT)还是间质上皮转换(mesenchymal-epithelial transition, MET).

创新盘点

本文较为系统的归纳和总结了肝细胞肝癌诱导分化治疗的研究意义和近5年国内外研究成果.

应用要点

本文总结了肝细胞肝癌诱导分化治疗的新方向和热点, 为肝细胞肝癌的诱导分化治疗提供新的理论依据和线索.

名词解释

EMT: 是指上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程.

同行评价

该综述选题为目前研究的热点问题, 因而具有重要的理论意义和应用价值. 文献综述部分对肝细胞肝癌诱导分化治疗的研究意义以及近5年国内外研究成果进行了较为系统的归纳和总结, 内容严谨, 归纳总结合情合理.

备注

编辑:于明茜 电编:都珍珍

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