文献综述 Open Access
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世界华人消化杂志. 2015-10-18; 23(29): 4652-4657
在线出版日期: 2015-10-18. doi: 10.11569/wcjd.v23.i29.4652
转基因2型自身免疫性肝炎动物模型研究进展
化雨, 陆鹏, 季菊玲, 邵建国, 王陆军
化雨, 邵建国, 南通大学附属南通第三医院消化内科 江苏省南通市 226006
陆鹏, 季菊玲, 南通大学医学院病理教研室 江苏省南通市 226006
王陆军, 南通大学附属南通第三医院中西医结合肝病科 江苏省南通市 226006
化雨, 在读硕士, 主要从事自身免疫性肝炎的研究.
基金项目: 国家自然科学基金面上资助项目, No. 81370520; 江苏省自然科学基金面上资助项目, No. BK2012653.
作者贡献分布: 选题由邵建国与季菊玲完成; 资料查阅与撰写由化雨完成; 陆鹏与王陆军修改.
通讯作者: 邵建国, 副教授, 主任医师, 博士生导师, 226006, 江苏省南通市青年中路99号, 南通大学附属南通第三医院消化内科. shaojianguo4144@163.com
电话: 0513-85116086
收稿日期: 2015-08-10
修回日期: 2015-09-16
接受日期: 2015-09-25
在线出版日期: 2015-10-18

自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis, AIH)是一种慢性肝损伤疾病, 目前认为多由自身肝细胞抗原诱发的免疫耐受丧失引起. 目前按自身抗原类型主要分为1型和2型AIH, 而2型AIH的自身抗原比较特异. 近年来, 针对2型AIH的小鼠模型日渐成熟, 特别是转基因模型的日趋完善, 为该疾病的研究提供了新的助力, 本文着重介绍近几年来几种较成功的小鼠AIH的模型.

关键词: 自身免疫性肝炎; 转基因; 动物模型

核心提示: 我国自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis, AIH)的发现率逐年升高, 针对2型AIH的小鼠转基因模型日趋完善, 为该疾病的研究提供了新的助力, 本文着重介绍近几年来几种较成功的小鼠AIH的模型.
引文著录: 化雨, 陆鹏, 季菊玲, 邵建国, 王陆军. 转基因2型自身免疫性肝炎动物模型研究进展. 世界华人消化杂志 2015; 23(29): 4652-4657
Transgenic animal models of type 2 autoimmune hepatitis
Yu Hua, Peng Lu, Ju-Ling Ji, Jian-Guo Shao, Lu-Jun Wang
Yu Hua, Jian-Guo Shao, Department of Gastroenterology, the Third Hospital of Nantong University, Nantong 226006, Jiangsu Province, China
Peng Lu, Ju-Ling Ji, Department of Pathology, Medical College of Nantong University, Nantong 226006, Jiangsu Province, China
Lu-Jun Wang, Department of Integrated Western and Chinese Medicine, the Third Hospital of Nantong University, Nantong 226006, Jiangsu Province, China
Supported by: National Natural Science Foundation of China, No. 81370520; Natural Science Foundation of Jiangsu Province, No. BK2012653.
Correspondence to: Jian-Guo Shao, Associate Professor, Chief Physician, Department of Gastroenterology, the Third Hospital of Nantong University, 99 Qingnian Middle Road, Nantong 226006, Jiangsu Province, China. shaojianguo4144@163.com
Received: August 10, 2015
Revised: September 16, 2015
Accepted: September 25, 2015
Published online: October 18, 2015

Autoimmune hepatitis (AIH) is a chronic liver disease putatively caused by loss of tolerance to hepatocyte specific autoantigens. It is currently divided into types 1 and 2, based on the expression of autoantibodies. Autoantigenic epitopes have been identified only for the less frequent type 2 AIH. Many type 2 AIH mouse models have been well developed in recent years. This review focuses on some kinds of well-established type 2 AIH mouse models.

Key Words: Autoimmune hepatitis; Transgenic; Animal Models
0 引言

自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis, AIH)在所有种族和年龄段均可发病, 主要影响女性(女:男 = 4:1), 在北欧的发病率为170/1000000至239/1000000[1], 亚洲地区发病率较低, 近年来随着免疫和生化等技术的不断进步, 我国AIH的发现率逐年升高[2]. 本病作为一种异常自身免疫反应为基础的疾病, 需长期免疫抑制剂治疗, 不经治疗则预后较差, 5年生存率50%, 10年生存率10%[3]. 即便经过治疗, 仍有10%-20%患者进展为肝硬化及终末期肝病[4]. 本病可以急性肝炎起病, 可慢性化致肝硬化、肝癌, 甚至需要肝移植才能挽救生命. 本病以血清转氨酶升高、循环中存在自身抗体、高γ-球蛋白血症、肝组织学特征性改变(界面性肝炎、汇管区淋巴浆细胞浸润和玫瑰花结样变)以及对免疫抑制治疗应答敏感为特点[2]. 根据血清中自身抗体的差异, 该病可分为1型AIH和2型AIH[5,6]. 其中2型AIH以1型抗肝肾微粒体抗体(anti-LKM1)和1型抗肝胞浆抗体(anti-LC1)为特征, anti-LKM1与anti-LC1靶基因分别为细胞色素P450 2D6(CYP2D6)及四氢叶酸环化脱氢酶(formiminotransferase cyclodeaminase, FTCD)[7-11]. 为了深入研究AIH的发病机制并寻找有效的治疗药物, 需要一个与人AIH相似的动物实验模型. 过去较经典的动物模型包括肝抗原、刀豆球蛋白(concanavalin A, ConA)、α-半乳糖基神经酰胺(α-galactosylceramide, α-Ga1Cer)诱导的肝模型及转基因模型. 但存在诱导方法复杂, 肝损伤持续较短, 造模效果不理想等缺点[12,13]. 近年来, 关于2型AIH小鼠模型多以2者为靶抗原, 利用分子拟态及异种免疫机制制作转基因小鼠模型, 以打破免疫耐受. 转基因模型较之前模型有较大进步.

1 经典动物模型在AIH研究中的应用
1.1 肝抗原诱导的肝炎模型

1983年, Kuriki以脂多糖为佐剂, 应用同种肝脏匀浆以肌肉注射的方式免疫SMA小鼠, 1次/mo, 共11次, 成功建立了实验性AIH(experimental autoimmune hepatitis, EAH)模型. 该模型肝内可见门管区中到重度淋巴细胞和浆细胞浸润, 并伴局灶性坏死, 且可见肝特异性抗体产生. 将肝损伤小鼠的脾细胞过继输入同种系小鼠可诱导肝炎, 提示了细胞免疫在实验性AIH中的作用[14-17]. 之后研究中发现C57BL/6小鼠对EAH的易感性, 提示基因背景在AIH中的重要作用[17].

由于中心耐受存在, 此类模型操作复杂, 需要多次免疫才能获得一过性轻中度肝实质损伤, 且造模过程依赖免疫佐剂. 肝抗原特异性不足, 且产生的抗体非AIH特异性抗体.

1.2 ConA诱导的肝炎模型

ConA作为植物凝集素, 非肝抗原, 能引起T细胞活化增殖, 诱导急性肝炎[13,18]. NMRI(naval medical research institute)小鼠静脉注射ConA造模, 成功建立肝炎模型. 该模型可见转氨酶明显升高, 细胞凋亡, 门管区和肝实质炎症浸润[19]. 在该模型基础上研究发现多种炎症因子[白介素(interleukin, IL)-2、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor α, TNF-α)、γ-干扰素(interferon-γ, IFN-γ)、细胞CD4+ T细胞、自然杀伤性T细胞、辅助杀伤性细胞17和肝巨噬细胞等]在小鼠肝炎发展中起重要作用[20-25].

该模型只需单次注射, 操作简单可重复性强. ConA非肝自身抗原, 缺乏肝自身抗原特异性效应T细胞, 且为急性病程与AIH慢性迁延特点尚有差别[26].

1.3 α-Ga1Cer

该模型通过单次静脉注射α-Ga1Cer免疫C57BL/6J小鼠建立了AIH模型, 表现出淋巴细胞浸润和自身抗体产生, 并发现NKT细胞和TNF-α在该模型诱导的肝损伤发展中起重要作用[27-29]. 并在随后研究中探讨了IFN-γ和IL-17在肝脏炎症中的可能的保护作用[30-36].

该模型只需单次注射, 操作简单. α-Ga1Cer类似于天然自身抗原, 经抗原特异性T细胞受体呈递, 接近AIH发病机制, 但肝内炎症为急性炎症反应.

2 转基因动物模型在AIH研究中的应用
2.1 慢病毒载体+双抗原模型

该类模型利用慢病毒载体搭载CYP2D6及FTCD靶基因(pCMV-CYP2D6-FTCD), 通过前小腿肌肉注射的方式, 转染6到8周龄C57BL/6♀小鼠. 同时, 编码IL-12的质粒也一起注入以获得更好的炎症反应效果. Lapierre等[37]于2004年介绍了该模型成功表现2型AIH的一系列特征: 显著升高的转氨酶水平, 丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase, ALT)超过正常小鼠2倍标准差, 最高值在60-70 U/L特征性抗体anti-LC1及anti-LKM1产生, 汇管区浆细胞浸润以及界面性肝炎. 该文章也探讨了IL-12在AIH中的作用, 其提高汇管及周围区浸润浆细胞数量, 升高血清中抗体水平并使其首次高峰提前到来(IL组为注射后第2月, 非IL组为注射后第3月), 促使转氨酶水平升高. 但其并不影响浆细胞分布情况, 无IL影响转氨酶水平仍显著升高[25,38-41].

随后在2006年的文章中, 在此模型基础上探讨了小鼠基因背景(易感性)在疾病发展中作用, 并比较了C57BL/6、BALB/c、129/Sv 3种小鼠在转氨酶、抗体、毒性T细胞、汇管区炎症和小叶炎症上的差异. C57BL/6小鼠在各水平上均表现优秀, 鉴于3种小鼠在MHC基因上的差异得出结论: MHC(H-2b)在疾病发生中起到必要但非充分条件, MHC基因与非MHC基因间复杂的相互作用与AIH的易感性有关[41]. 2010年则验证, 探讨了AIH中性别和年龄差异的现象和机制, 排除了雌激素对女性易感的直接影响作用, 证实了调节性T细胞的数量差异对女性易感的影响作用以及外周耐受丧失对AIH发生发展的重要作用[42]. 2013年尝试自体移植体外扩增的调节性T细胞诱导AIH小鼠恢复自身抗原的外周耐受并成功, 为该疾病的治疗提供了新思路[43]. 2015年在小鼠身上验证了低剂量抗CD3抗体诱导疾病缓解[44].

该模型炎症明显, 表现出汇管区浸润, 界面性肝炎, 转氨酶水平显著升高, 有2种特征性抗体anti-LC1及anti-LKM1产生. 但无纤维化出现, 且其造模方法较复杂需反复多次注射, 需要额外注射IL-12, 此外其实验周期为8 mo, 耗时较长.

2.2 腺病毒载体+双抗原模型

Piché等[45]于2011年利用腺病毒搭载FTCD及CYP2D6(RecAdV-CTLA4-2D6-FTCD)2种靶基因分别通过静脉(尾静脉)及肌肉(前小腿)注射2种方式成功诱发小鼠迟发型AIH. 均表现出汇管及周围区浆细胞浸润, 持久的抗体反应, 转氨酶水平仅短暂升高且意义不大. 二者炎症程度及持续时间明显差异, 且介于不同注射方式抗原表达部位不同(外周和肝脏)论证了肝脏炎症损伤在本疾病发展中并无必要作用, 实验中观察到抗原表达部位不同对B细胞反应产生的球蛋白种类影响较大. 实验证实了自身免疫肝抗原可以通过分子拟态原理在相当长一段时间(8 mo)后诱发AIH, 从而支持了后效应作用假说. 也提供了嗜肝或非嗜肝病毒在迟发型AIH病因学作用的研究思路. 该模型无纤维化出现, 实验周期过长达8 mo.

2.3 腺病毒载体+CYP2D6单抗原模型

2008年, Holdener等[46]使用腺病毒搭载CYP2D6(Ad-CYP2D6)通过一次性静注和腹腔注射感染♀FVB小鼠造模2型AIH, 小鼠表现持续性肝炎, 出现白细胞浸润, 肝纤维化, 肝小叶结构混乱及坏死, 并检测到1型肝肾微粒体抗体的存在. 这一造模方式简洁, 且肝炎表现持久并首次诱导了包膜下肝纤维化. 2012年详细介绍了成熟的造模方法及技术细节[47]. 2013-01证明不同感染路径对肝纤维化效果的影响[48]. 腹腔注射腺病毒多表达于包膜附近, 而静脉注射则表达于整个肝小叶. 腹腔注射时, 包膜处自然杀伤细胞(natural killer cell)细胞缺失, 致肝星形细胞逃脱杀伤是形成包膜下纤维化的主要原因. 2013-02论证了相似性抗原较同源抗原更易打破宿主T细胞免疫耐受, 分子拟态而非同源性诱发了强劲的T细胞反应[49].

该模型诱导出包膜下纤维化(腹腔注射), 但其与AIH自体产生的纤维化尚有出入[21], 其转氨酶水平仅早期短暂升高且多为腺病毒而非抗原反应引起, 但其试验周期仅为8 wk, 且造模方式简单, 腺病毒只需注射1次.

2.4 腺病毒载体+FTCD单抗原模型

2013年, Hardtke-Wolenski等[50]的文章中提到另一种方法, 用腺病毒搭载FTCD(Ad-FTCD)感染NOD小鼠制作2型AIH模型, 并于注射后第12周出现汇管及周围区淋巴细胞浸润, 界面性肝炎, 小叶内微肉芽肿和点状坏死. 转氨酶水平仅短暂升高且意义不大, 值得注意的是, 在试验中部分小鼠(4/8)出现门脉至汇管周围桥接区纤维化, 较为符合自免肝特征. 该试验周期为12 wk. 4种模型特点总结如.

3 结论

转基因模型在近几年取得长足的进步, 改善了多为急性肝炎且肝损伤短暂, 抗原特异性差, 无特征性抗体, 造模方法复杂等问题, 但仍存在一定程度免疫耐受, 且难以获得自发性免疫耐受模型. 理想的AIH动物模型应具备以下特点: (1)自发自身抗原免疫诱发; (2)组织学改变持续且可持续发展为肝纤维化及肝硬化(目前纤维化案例或不典型或不成熟); (3)自身抗体谱与人类相似; (4)慢性起病, 病情迁延. 虽然目前AIH动物模型尚不完善, 但随着动物科学, 免疫科学等学科的不断进步, 动物模型必将不断完善, 并在AIH的研究中发挥重要作用.

评论
背景资料

目前国内对自身免疫性转基因小鼠动物模型应用尚不广泛, 在此介绍几种较为成熟的动物模型以提供新的思路.

同行评议者

刘芳芳, 副主任医师, 北京大学人民医院病理科

研发前沿

自身免疫性转基因小鼠动物模型的应用将对AIH的研究产生新的助力.

同行评价

本文介绍了利用分子拟态及异种免疫机制制作转基因2型自身免疫性肝炎小鼠模型的4种方法及其优缺点, 提出转基因模型较过去的动物模型包括肝抗原、刀豆球蛋白、α-半乳糖基神经酰胺诱导的肝模型等有较大进步. 该综述具有一定的意义.

编辑:于明茜 电编:都珍珍

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