修回日期: 2014-11-07
接受日期: 2014-11-18
在线出版日期: 2015-01-08
胃癌目前仍是我国发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一, 5年生存率仅10%左右, 因此肿瘤早期诊断是临床亟待解决的问题. 近十年来, 血液循环肿瘤细胞(circulating tumour cell, CTCs)和循环肿瘤DNA(circulating tumour DNA, ctDNA)因其具有无创、实时检测和早于影像学检查结果等优点, 得到了肿瘤学界的广泛关注, 被称为"液体活检". 大量的文献报道CTCs和ctDNA甲基化在肿瘤诊断、疗效监测和预后评估方面具有价值. 本综述系统介绍CTCs和ctDNA的生物学特性以及在胃癌临床中意义、临床转化前景和挑战.
核心提示: 循环肿瘤细胞(circulating tumour cell)和循环肿瘤DNA(circulating tumour DNA)能够对肿瘤的早期诊断、放化疗药物的疗效评估、肿瘤负荷和进展监测提供可靠的信息, 具有无创、实时检测和早于影像学检查结果等优点, 在肿瘤诊断、疗效监测和预后评估方面具有价值.
引文著录: 方超萍, 颜宏利, 谷明莉, 贾音, 贺琤雯, 田兆峰, 符永叶, 邓安梅. 循环肿瘤细胞及游离DNA甲基化在胃癌中的研究进展. 世界华人消化杂志 2015; 23(1): 44-50
Revised: November 7, 2014
Accepted: November 18, 2014
Published online: January 8, 2015
Gastric cancer is still one of malignant tumors with the highest morbidity and mortalit in China, and the 5-year survival rate is only 10%. Circulating tumor cells (CTCs) and cell tumor DNA (ctDNA) have gained increasing interests during the past decade. A wealth of information indicating the potential value of CTCs and ctDNA for cancer diagnosis, monitoring of the efficacy of anticancer therapies and prognosis has emerged. In this review, we discuss the biology and potential clinical use of CTCs and ctDNA in gastric cancer, as well as their role in the management of cancer patients.
- Citation: Fang CP, Yan HL, Gu ML, Jia Y, He CW, Tian ZF, Fu YY, Deng AM. Circulating tumor cells and cell tumor DNA methylation in gastric cancer: From bench to bedside. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2015; 23(1): 44-50
- URL: https://www.wjgnet.com/1009-3079/full/v23/i1/44.htm
- DOI: https://dx.doi.org/10.11569/wcjd.v23.i1.44
胃癌目前仍是我国发病率和死亡率最高的恶性肿瘤. 全球每年新发100余万例, 死亡约80万例, 文献资料显示胃癌5年生存率仅为10%左右[1]. 近年来, 检测手段和治疗方法上的进步使胃癌患者的临床效果有所改善, 但其确诊太晚、极高的转移和复发率仍是临床需要解决的主要问题. 研究表明在肿瘤形成的早期阶段, 即可释放肿瘤细胞和DNA至外周血, 形成循环肿瘤细胞(circulating tumour cell, CTC)及游离DNA[2-4], 这为我们对胃癌的进一步深入研究、早期诊断、疗效观察及转移复发预测等提供了新的平台.
CTC是指自发或因诊疗操作进入外周血循环的肿瘤细胞. 关于CTC的报道, 最早可以追溯到1869年, Ashworth[5]在1例转移性癌症患者的外周血中发现存在和原发肿瘤组织相似的细胞, 目前认为这种脱离原发肿瘤组织进入外周血的CTC是引起肿瘤转移的原因之一. 这种脱离原发肿瘤组织的CTC可以转移至远处其他组织形成病灶再次入血形成CTC, 这也是CTC的主要来源, 而这两种方式来源的CTC具有一定的异质性[6-8]. 进入循环的肿瘤细胞绝大多数在短期内死亡, 只有极少数具有高度活力、高度转移潜能的肿瘤细胞在循环系统中存活下来, 相互聚集形成微小癌栓, 并在一定条件下发展为转移灶. 因此, 在外周血中检测到肿瘤细胞预示着有可能发生肿瘤转移. CTC检测技术近年来发展迅速, 被认为是一个可靠的预后指标, 目前已在乳腺癌、肺癌和结直肠癌中广泛应用, 能够为临床进展和预后等提供极具价值的判断依据[9-11].
游离DNA是一种无细胞状态的胞外DNA, 主要是由单链或双链DNA以及单链与双链DNA的混合物组成, 以DNA-蛋白质复合物或游离DNA两种形式存在[12]. CTC及转移灶中的肿瘤细胞也会因为坏死和凋亡向外周血释放DNA, 形成循环游离肿瘤细胞DNA. 肿瘤患者中循环肿瘤细胞DNA只是循环游离DNA的一部分, 其他非肿瘤细胞在坏死和凋亡时也可以向外周血释放DNA形成循环游离DNA. 研究发现肿瘤患者循环中游离DNA的水平通常要高于健康个体, 并且游离DNA表现出与肿瘤组织相同的生物学特性, 说明肿瘤患者中循环肿瘤细胞DNA是循环游离DNA的主要来源. 健康人外周血游离DNA大多来源于血细胞. 目前, 关于恶性肿瘤患者循环肿瘤细胞DNA的来源及其发生机制有以下3种观点: (1)肿瘤细胞不断释放DNA进入血液循环. 肿瘤在生长过程中能持续自发释放肿瘤细胞DNA进入外周血液, 成为循环血DNA的主要来源; (2)循环中肿瘤细胞或微转移灶的裂解. 常见的观点是认为肿瘤患者存在循环肿瘤细胞或者微转移灶细胞, 其裂解是血浆中DNA的主要来源, 但外周血中显然没有足够的肿瘤细胞能产生如此高水平的游离DNA; (3)肿瘤细胞的坏死或凋亡. 通过对胃肠肿瘤、乳腺癌、肺癌、头颈肿瘤、泌尿系统肿瘤、妇科肿瘤和皮肤癌等多种肿瘤的研究, 游离循环肿瘤细胞DNA的检测被认为是一个潜在的肿瘤早期诊断和预后判断的有力手段.
CTC的检测主要包括两个步骤: 分离富集与鉴定. 由于CTC在外周血中密度较低, 为提高检测的效率, 必须先将CTC与血细胞分离出来并富集. 分离的方法主要有两种. 第一种方法是利用肿瘤细胞与血细胞的形态学差异来分离CTC; 不破坏细胞的结构, 分离后的细胞可继续进行免疫组织化学或免疫荧光等相关研究. 但该方法特异性较差, 易出现假阳性, 因而较为少用; 第二种方法是采用免疫学手段进行分离. 大部分上皮来源的肿瘤细胞都有表达上皮细胞黏附分子(epithelial cells adhesion molecule, EpCAM)以及细胞角蛋白(cytokeratin, CK)等抗原, 而血液中骨髓来源的细胞则表达CD45等分子[13]. 利用包被了抗体的磁颗粒结合特异性抗原并加以分选的方法, 可将CTC从外周血中分离富集出来.
Cel1Search循环肿瘤细胞检测系统为强生(veridex)旗下产品, 是全球首个也是唯一经过美国食品药物管理署(Food and Drug Administration, FDA)批准用于检测血液中CTC的商品化产品. 其基本原理: 利用免疫纳米磁颗粒富集上皮来源的细胞, 纳米磁颗粒包被了抗EpCAM特异性抗体, 通过抗原抗体反应纳米磁颗粒会与血液中表达EpCAM的细胞结合, 从而捕获CTC, 细胞内角蛋白荧光抗体识别上皮细胞、白细胞荧光抗体识别白细胞以及DAPI染料用来对细胞核进行染色生成细胞图像共同识别CTC. CK-PE+、DAPI+和CD45-的细胞即为CTC. 该检测可自动分选从上皮性肿瘤脱落后进入血液中的肿瘤细胞[14,15], 只需7.5 mL血液样本, 即可从400多亿血细胞中检测到一个CTC. 已被国外临床试验证明可有效预测转移性乳腺癌、前列腺癌和结直肠癌的预后及无进展生存期(progression free survival, PFS)和总生存期(overall survival, OS). 该系统对CTC的检测特异性好(99.7%), 重复率高(99.4%), 可用于临床及科研上对CTC的检测. FDA认证, CellSearch-CTC计数可作为转移性乳腺癌、结直肠癌和前列腺癌患者生存率的独立预测因子. 通过对CTC进行连续监测, 能够在治疗期间随时评估患者的预后情况. CTC计数和映像学一样是良好的诊断指标, 且CTC计数可以更早的提示患者的预后信息.
除了CTC计数以外, 对CTC的分子改变也引起了研究者的极大兴趣. Cui等[16]发现CTC中piR-651和piR-823水平在胃癌患者的外周血中显著低于正常对照组. Zhou等[17]发现胃癌CTC中的miR-421水平显著高于健康组, miR-421抑制剂的转染能显著抑制体内的肿瘤生长. Cao等[18]研究了98例胃癌患者外周血CTC中的Survivin的表达, 认为Survivin mRNA状态和病理性肿瘤标记一样是无病生存期的独立预测因素. Survivin mRNA高表达预示着根治性切除术后肿瘤的复发. Arigami等[19]用定量RT-PCR评价B7-H3 mRNA在4种胃癌细胞株、95例胃癌患者和21例健康人外周血中的表达. 结果证实B7-H3 mRNA在4种胃癌细胞株中均有表达; 胃癌患者外周血中B7-H3 mRNA的拷贝数明显高于健康组, 在高B7-H3 mRNA表达的患者中5年生存率显著低于低表达者. 有人收集了53例胃癌术前患者和20例健康志愿者外周血, 采用RT-PCR检测miR-21、miR-106a和miR-17水平, 结果胃癌患者的上述microRNA水平明显高于对照组, 且microRNA水平与TNM分期、肿瘤大小、组织学分类有关联. 提示检测外周学中miR-21、miR-106a和miR-17可能是监测胃癌患者CTC的一种新的工具[20-22]. Wang等[23]用RT-PCR检测胃癌患者外周血和肿瘤组织中MAGE-1和MAGE-3 mRNA的表达, 结果40例患者中, MAGE-1和MAGE-3 mRNA的阳性率外周血中分别为47.5%和25%; 在胃癌组织中分别为62.5%和30%; MAGE mRNA在肿瘤组织中不表达的在外周血中也不表达. 20例健康者中未检测到MAGE mRNA表达. 提示他们可能作为检测循环胃癌细胞的特异肿瘤标志物.
抑癌基因启动子甲基化是抑癌基因失活的一个重要机制, 他在多种肿瘤的发生、发展过程中起到了非常重要的作用. 基因的异常甲基化在头颈癌、鼻咽癌、乳腺癌、食管癌、胃癌和大肠癌患者的血浆中均已检测到. p14属于INK4a/ARP位点的肿瘤抑制基因. 通过对胃癌细胞株的分析发现[24,25]: 7个细胞株中有5个不表达该基因mRNA, 进一步分析发现, 启动子甲基化是p14基因沉默的重要调节机制. 对胃癌标本分析发现[26], 扩散型胃癌p14启动子甲基化率为45.5%. p15为CDKIs抑制剂, 属于肿瘤抑制基因. 在胃癌中p15缺失或突变十分少见, 但由于其CpG岛甲基化而导致其mRNA转录异常, 这样就导致该基因失活, 从而成为影响胃癌形成的一种方式. Leung等[27]研究发现有68%的胃癌患者肿瘤组织中可以发现p15启动子甲基化, 而相应的患者血浆中有81%发现p15启动子甲基化. 在胃癌患者血浆中O6-甲基鸟嘌呤-甲基转移酶(O6-methylgua-nine DNA methyltransferase, MGMT)、p15、错配修复基因1的异常甲基化检出率分别为59%、40%、41%. 而在正常人体内相应基因的异常甲基化检出率仅有34%、13%、8%. Kolesnikova等[28]、Tani等[29]采用甲基化特异聚合酶链反应(methylation specific polymerase chain reaction, MSP)法检测MGMT、p15、hMLH1的甲基化状态, 并以22例健康者作对照. 结果在20例胃癌患者血浆中检测到MGMT、p15和Hm-LH1基因甲基化阳性率分别为50%、70%和25%, Ⅲ、Ⅳ期及远处转移患者甲基化阳性率分别为90%、90%和60%, 而健康对照者血浆中均无异常甲基化. Leung等[30,31]用甲基化特异的PCR法对5种胃癌细胞株, 26例冰冻胃癌组织的p15和p16的甲基化状态进行检测发现, 4个胃癌细胞株有p15的甲基化紊乱, 3个细胞株有p16的甲基化紊乱, 26例胃癌患者有73.1%存在p15的高甲基化, 64.5%存在pl6的高甲基化. 这一结果表明多肿瘤抑制基因p15和p16基因的失活与胃癌的发生有关. 有作者[32-34]发现原发性胃癌中p15和p16基因的突变并不多见. mRNA表达下调多因DNA甲基化的紊乱所致. 他们认为DNA甲基化可能是p16基因失活的一条途径. Shim等[35]用MSP检测胃癌中的p16甲基化水平, 42%胃癌有高甲基化, 甲基化阳性病例中22例有19例完全的p16免疫活性丢失, 而甲基化阴性病例19例只有2例. p16高甲基化同免疫活性的相关性表明, 甲基化是胃癌中p16失活的重要机制. Song等[36]分析了9个胃癌细胞系, 发现p16表达失活伴有启动子区的高甲基化. 28例患者中的6例有p16表达缺失, 5例有启动子区的高甲基化. 体外研究表明, 胃癌患者因p16启动子甲基化而不表达p16蛋白的为22%, 而胃炎患者该基因启动子没有甲基化现象, 43%的胃癌和59%的癌组织附近的癌前病变组织出现p16启动子甲基化现象, 这说明该基因启动子甲基化发生在胃癌形成的早期, 而且频率较高, 可成为胃癌危险性的预测性生物标记[37-42]. Sakakura等[43]检测了65例胃癌患者术前与术后血清中Runx3(Runt related transcription factor 3 gene)的甲基化水平, 发现29%(19/65)的患者术前血清中能够检测到Runx3甲基化, 并且Runx3的甲基化系数与肿瘤的级别、组织类型、有无淋巴及浸润转移相关, 其敏感性较CEA高. 而术后血清中Runx3甲基化水平明显下降. 由此可见, DNA甲基化异常同样可作为肿瘤标志物用于血游离DNA的检测. 通过对胃癌APC基因的分析发现APC基因没有发生突变, 通过MSP对胃癌标本和胃癌细胞株的分析发现: 82.5%的原发性胃癌、97.5%胃癌患者的癌旁胃黏膜和10个胃癌细胞株APC启动子lA呈高甲基化, 而启动子1B却没有发生甲基化[44-49]. 由于甲基化, 在10个细胞株中, 外显子1A没有出现APC表达, 而外显子1B却出现APC表达. 说明APC启动子1A甲基化在胃癌形成的早期就出现, 是有用的生物标记.
CTCs检测是实时、动态反映疾病分子特征的窗口, 简单无创, 被称为"液体活检", 越来越多的研究表明, 循环肿瘤细胞在肿瘤的早期诊断、预后判断、药效检测等方面具有重要作用. 尤其是患者化疗或靶向治疗后, 肿瘤组织已经难以获得, 检测CTCs就成为动态监测药物疗效和肿瘤进展情况无可替代的工具. 但是, 应该明确的是CTCs和循环肿瘤DNA在肿瘤患者血液中的含量很低. 目前有不同的商业化技术平台或方法用于CTCs或循环肿瘤DNA的检测. 由于不同检测方法的敏感性和特异性的差异, 未实现标准化, 因此难以对不同研究机构的检出结果进行比对; 其次, 使用单一上皮分子标志物来检测CTCs, 极有可能漏检一部分完成EMT的CTCs, 这也使得现如今研究者们对利用CellSearch计数CTCs评判转移性肿瘤预后和疗效监测存在质疑; 其三, 肿瘤是一个高度异质性的细胞群体, 在不同肿瘤、肿瘤的不同发展阶段, CTCs和循环肿瘤DNA具有不同的分子特征, 这无疑增加了CTCs和循环DNA作用肿瘤标志物的临床转化难度. 随着高通量测序平台以及单细胞基因组扩增技术的进步, CTCs的未来朝着单细胞组学发展; 循环肿瘤DNA的发展方向则是在二代测序的基础上明确新的分子标志物[50].
近几年由于研究甲基化手段的进步, 使更多的胃癌相关基因甲基化情况得以明确, 但迄今为止尚未见临床上利用上述胃癌相关基因甲基化状态的改变进行胃癌的早期诊断及干预甲基化的基因治疗来防治胃肠系肿瘤的发生. 目前循环DNA甲基化主要是在全血中检测, 如能在富集分离的CTC中检测或许能有更高的阳性率, 胃癌的分子特征也有待进一步明确. 希望通过CTC计数和循环胃癌细胞DNA及其甲基化的检测和分析, 寻找并筛选出一些敏感性和特异性更高的分子指标, 为实现胃癌的早期诊断, 提供良好的靶点进行个体化治疗, 为肿瘤学的临床应用开辟一个新的领域.
胃癌是源自胃黏膜上皮的恶性肿瘤, 占全部恶性肿瘤的第3位, 占消化系恶性肿瘤的首位. 近年来我国胃癌的发病率呈明显上升趋势, 严重威胁人类健康. 早期胃癌多无症状或仅有轻微症状. 当临床症状明显时, 病变已属晚期. 因此寻找新的分子标志物, 进行肿瘤的早期诊断和分子分型是胃癌研究的热点.
郑鹏远, 教授, 主任医师, 博士生导师, 副院长, 郑州大学第二附属医院消化科
近年来的研究发现, 在胃癌发生发展的早期阶段即有肿瘤细胞及其DNA释放入血, 检测血液循环肿瘤细胞(circulating tumour cell, CTCs)和循环肿瘤DNA(circulating tumour DNA, ctDNA)能够对肿瘤的早期诊断、放化疗药物的疗效评估、肿瘤负荷和进展监测提供可靠的信息. 因其具有无创、实时检测和早于影像学检查结果等优点, 得到了肿瘤学界的广泛关注, 被称为"液体活检". 大量的文献报道CTCs和ctDNA甲基化在肿瘤诊断、疗效监测和预后评估方面具有价值.
Cristofanilli、Cohen等通过多中心、双盲、前瞻性的临床研究, 利用CellSearch检测CTCs, 在转移性乳腺癌、转移性结直肠癌中建立了评判预后的CTCs阈值. Misale等发现在给予肿瘤组织K-RAS野生型的转移性结直肠癌患者靶向EGFR的治疗药物, 部分耐药患者的ctDNA中检出K-RAS的突变.
本文系统介绍了血液循环肿瘤细胞和血液肿瘤DNA在胃癌早期诊断、病情监测、药物疗效评估的应用, 并着重介绍了血液肿瘤DNA的甲基化在胃癌诊断和发病中的作用, 给临床医生提供了一个新的视野, 具有较好的创新性.
由于美国FDA最初批准CellSearch系统的临床应用是乳腺癌、结直肠癌和前列腺癌, 所以CTCs在这3种肿瘤的研究较多. 随着人们对CTCs和ctDNA在肿瘤诊断、疗效监测等领域的认识不断深入, CTCs和ctDNA在胃癌、胰腺癌和肺癌等其他肿瘤中的诊断价值也逐渐得到了人们的重视.
本综述系统介绍CTCs和ctDNA的生物学特性以及在胃癌临床中意义、临床转化前景和挑战. 本文写作规范, 引用文献权威, 对临床医师了解该领域的进展有较大的帮助.
编辑:郭鹏 电编:都珍珍
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