HIF-1α、NF-κB在大鼠不同程度非酒精性脂肪肝中的表达

摘要

目的: 探讨缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor 1α, HIF-1α)、核因子-κB(nuclear factor kappa B, NF-κB)在非酒精性脂肪肝炎(non-alcoholic fat liver diseases, NAFLD)进展中的作用及其机制.

方法: 选50只♂SD大鼠随机分为正常组、模型组(高脂饮食4、8、12及16 wk组), 每组10只. 通过高脂饲料建立大鼠脂肪肝模型, 取外周血及肝脏组织, 进行血脂、肝功能、空腹血糖及病理组织学检查. Real-time-PCR法检测肝组织中HIF-1α、NF-κB的mRNA水平, 多组计量资料比较采用成组设计的方差分析、Kruskal-Wallis H检验, 两两比较采用LSD法, P<0.05为差异有统计学意义.

结果: 在高脂饮食第12周、16周, 模型组的丙氨酸氨基转移酶(alanine amiotransferase, ALT)、三酰甘油(triglyceride, TG)和胆固醇(cholesterol, CHOL)水平与正常组相比均显著升高(P<0.05), 而高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol, HDL-C)的表达则显著下降(P<0.05). HIF-1α和NF-κB表达随着高脂饮食时间的延长, 表达逐渐升高(P<0.05), 与脂肪肝的严重程度呈正比, 且HIF-1α的表达与NF-κB具有相关性(r = 0.67, P<0.05).

结论: HIF-1α/NF-κB信号在大鼠NAFLD的进展中起着一定的促进作用.

关键词: 非酒精性脂肪肝; 缺氧诱导因子-1α; 核转录因子-κB; 表达

核心提示: 本研究发现, 随着脂肪肝的进展, 缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor 1α, HIF-1α)和核因子-κB(nuclear factor kappa B, NF-κB)表达逐渐增强, HIF-1α可能通过激活NF-κB可能参与到非酒精性脂肪肝病(nonacoholic fatty liver disease, NAFLD)的发生和发展. 提示HIF-1α/NF-κB通路可能成为NAFLD发生与发展的重要分子生物学机制. 抑制非经典HIF-1α/NF-κB通路可能成为治疗NAFLD的新方向.

Expression of HIF-1α and NF-κB in non-alcoholic fat liver disease in rats

Hai-Jiao Chen, Peng-Fei Liu, Wei Zhang, Xin-Pu Yu, Yi Gao, Wei-Dong Shen

Hai-Jiao Chen, Peng-Fei Liu, Wei Zhang, Xin-Pu Yu, Yi Gao, Wei-Dong Shen, Department of Gastroenterology, the Affiliated Jiangyin Hospital of Nantong University, Jiangyin 214400, Jiangsu Province, China

Hai-Jiao Chen, Central Laboratory, the Affiliated Jiangyin Hospital of Nantong University, Jiangyin 214400, Jiangsu Province, China

Supported by: the Open Fund of Key Laboratory of Molecular Imaging in Jiangsu Province, No. PYZX2011012; the Wuxi Municipal Bureau of Science and Technology Fund, No. CSZ00N1249.

Correspondence to: Wei-Dong Shen, Associate Chief Physician, Department of Gastroenterology, the Affiliated Jiangyin Hospital of Nantong University, 163 Shoushan Road, Jiangyin 214400, Jiangsu Province, China. shenwd1976@126.com

Received: July 29, 2014
Revised: September 21, 2014
Accepted: October 29, 2014
Published online: December 18, 2014

Abstract

AIM: To investigate the role of hypoxia-inducible factor -1α (HIF-1α) and nuclear transcription factor κB (NF-κB) in the development of non-alcoholic fat liver disease (NAFLD) using a rat model.

METHODS: Fifty SD rats were randomly divided into five groups (a normal group, a 4 wk model group, an 8 wk group, a 12 wk and a 16 wk group). NAFLD was induced in rats by administration of a high fat diet. Serum biochemical parameters were tested, and fiver histological changes were observed. HIF-1α and NF-κB mRNA expression was detected by real-time PCR.

RESULTS: Compared with the normal group, significant elevations of serum alanine amiotransferase (ALT), triglyceride (TG), and cholesterol (CHOL) and reduction of high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) were observed in rats given a high fat diet for 12 wk or 16 wk (P < 0.05). In the model groups, liver steatosis, inflammation grade and degree of fibrosis were significantly aggravated. HIF-1α and NF- κB expression increased gradually with the severity of NAFLD (P < 0.05).

CONCLUSION: HIF-1α/NF-κB signaling may be related to the development of NAFLD.

Key Words: Non-alcoholic fat liver disease; Hypoxia-inducible factor-1α; Nuclear transcription factor κB; Expression

0 引言

非酒精性脂肪肝病(nonacoholic fatty liver disease, NAFLD)是一种无过量饮酒史, 以肝实质细胞脂肪变性和脂肪贮积为特征的临床病理综合征. 随着我国人民生活水平的不断提高和饮食结构的改变, NAFLD的发病率不断上升, 严重危害人们的健康[1,2]. 缺血缺氧在肝细胞的急慢性损伤中的作用日益引起重视, 细胞缺氧也是酒精性肝病的重要特征之一, 但在NAFLD中的研究依然较少, 机制也尚不明确[3-7]. 缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor 1α, HIF-1α)是一种受低氧诱导的对氧浓度高度敏感的转录因子, 是组织缺氧的内在标志, 通过诱导糖酵解、红细胞生成和血管生成HIF-1α有助于恢复体内的氧平衡[8-10]. 核因子-κB(nuclear factor kappa B, NF-κB)也是应对缺氧反应的一个关键性转录因子[11,12]. 本研究拟检测HIF-1α、NF-κB在NAFLD进展过程中的表达, 从而进一步探讨非酒精性脂肪肝的进展机制.

1 材料和方法

1.1 材料

野生型大鼠(购自上海斯莱克实验动物有限公司), 高脂饲料配比如下: 基础饲料87.8%、猪油10.0%、胆固醇2.0%、胆盐0.2%, 麻醉剂、酸性甲醛固定液、HE染色液以及TRIzol等RNA提取试剂(购自徐州博立达生物技术有限公司), 逆转录试剂盒和Real-time SYBR Green试剂(购自大连Takara公司), 引物(表1)由上海生工生物工程股份有限公司合成, 采血针和采血管均购自BD公司. 自动生化学分析仪, 7900HT荧光定量PCR仪(ABI公司), 正置荧光显微镜(Leica公司).

表1 荧光定量PCR引物序列表.

基因名称	引物序列	扩增长度(bp)
GAPDH	F: 5'-CCTTCATTGACCTCAACTACATG-3'	215
	R: 5'-CTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3'
NF-κB	F: 5'-GACCTGGAGCAAGCCATTAG-3'	125
	R: 5'-CGCACTGTCACCTGGAAGC-3'
HIF-1α	F: 5'-CCTACTATGTCGCTTTCTTGGA-3'	196
	R: 5'-TTCTGCTGCCTTGTATGGG-3'

F: 上游引物, R: 下游引物. HIF-1α: 缺氧诱导因子1α; NF-κB: 核因子κB.

1.2 方法

1.2.1 造模及分组: 野生型大鼠(购自上海斯莱克实验动物有限公司)饲养1 wk后, 进行高脂饮食. 根据我们前期研究, 大约在高脂饮食后4、8、12 wk可分别形成轻度、中度、重度脂肪肝及脂肪性肝炎模型(分别为10只). 正常对照组给予基础饲料, 高脂饮食组饲料配比如下: 基础饲料87.8%、猪油10.0%、胆固醇2.0%、胆盐0.2%, 自然采食. 分别于不同时相以0.1 g/kg体质量氯胺酮麻醉大鼠, 腹主动脉采血, 切取肝脏右叶0.5 cm×0.4 cm×0.5 cm大小组织块浸泡在100 g/L酸性甲醛固定液中, 剩余肝脏储存于液氮中备用. 甲醛固定后进行石蜡切片, HE染色, 检测大鼠肝标本, 判断脂肪肝严重程度, 以及明确脂肪性肝炎及肝纤维化情况.

1.2.2 血清中指标测定: 3000 r/min离心血液10 min, 取上层血清, 通过采用自动生化学分析仪测定丙氨酸氨基转移酶(alanine amiotransferase, ALT)、三酰甘油(triglyceride, TG)、胆固醇(cholesterol, CHOL)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol, HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C).

1.2.3 Real-time-PCR检测不同脂肪肝组织中HIF-1α、NF-κB mRNA表达: TRIzol法提取组织总RNA, 并逆转录为cDNA, 并配制反应体系, 将反应液加入384-Well Clear Optical Reaction Plate内, 每列16个孔均加入同一基因、不同样品的反应体系. 每个反应均设重复孔; 将加完样的384-Well Clear Optical Reaction Plate置入7900HT荧光定量PCR仪中(引物序列如表1), 按如下的反应条件进行PCR扩增和荧光定量(扩增条件: 95 ℃ 1 min, 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 60 s, 40个循环; 60 ℃ 15 s, 最后95 ℃15 s). 荧光定量数据分析采用参照基因的△Ct法计算每个样本目的基因的表达值, 其中△Ct值表示基因反应产物的荧光值达到设定的域值时的反应循环数.

统计学处理 应用SPSS16.0进行统计分析. 计量资料用mean±SD表示, 计数资料用整数表示. 组计量资料比较采用成组设计的方差分析、Kruskal-Wallis H检验, 两两比较采用LSD法, P<0.05为差异有统计学意义.

2 结果

2.1 大鼠脂肪肝模型的建立及病理情况

HE染色光镜下显示正常组大鼠肝组织结构完整, 肝细胞形态规则; 经高脂饮食4、8、12 wk可分别形成轻度、中度、重度脂肪肝形成, 16 wk可见明显脂肪性肝炎形成(表2). 肝组织脂肪变程度(F)按低倍镜下视野内脂肪变肝细胞占全部肝细胞的范围分级(F0-3): F0, 无脂肪变; F1(轻度), 33%以下肝细胞脂肪变; F2(中度), 33%-66%肝细胞脂肪变; F3(重度), 66%以上肝细胞脂肪变(图1). 非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis, NASH) 的炎症分级和纤维化分期标准参照改良的Brunt标准. NASH炎症程度(G0-3)分级: G0, 无炎症; Gl, 腺泡3带呈现少数气球样肝细胞, 腺泡内散在个别点灶状坏死; G2, 腺泡3带明显气球样肝细胞, 腺泡内点灶状坏死增多, 门管区轻、中度炎症; G3, 腺泡3带广泛气球样肝细胞, 腺泡内点, 灶状坏死明显, 门管区轻、中度炎症伴(或不伴)门管区周围炎症[13].

图1 不同程度脂肪肝病理结果(×100). A: 轻度脂肪肝; B: 中度脂肪肝; C: 重度脂肪肝; D: 脂肪性肝炎.

表2 各组大鼠脂肪变分级、炎症分级及纤维化分期.

分组	时间	脂肪变	炎症	纤维化
对照组		0.00±0.00	0.00±0.00	0.00±0.00
模型组	4 wk	1.24±0.34	0.00±0.00	0.00±0.00
	8 wk	2.28±0.34	1.36±0.44	0.00±0.00
	12 wk	3.00±0.00a	2.50±0.24a	1.76±0.84
	16 wk	3.00±0.00a	3.00±0.00a	2.45±0.59a

^aP<0.05 vs 对照组.

2.2 大鼠不同程度脂肪肝的肝功能及血脂水平

各组空腹血糖水平与正常对照组差异无统计学意义, 在高脂饮食第12、16周, ALT、TG、CHOL水平较正常组显著升高(P<0.05), 而HDL-C则显著下降(P<0.05)(表3).

表3 不同组各时间点大鼠肝功能及血脂水平.

分组	时间	ALT(U/L)	GLU(mmol/L)	TG(mmol/L)	HDL-C(mmol/L)	CHOL(mmol/L)
对照组		73.5±11.25	8.50±1.24	0.75±0.59	2.15±0.29	0.39±0.18
模型组	4 wk	93.5±10.65	8.90±1.35	0.94±0.51	2.40±1.02	0.44±0.19
	8 wk	92.0±19.06	8.59±2.01	0.67±0.38	2.00±0.68	0.48±0.27
	12 wk	103.17±18.76a	9.20±3.35	1.11±0.18a	0.61±0.18a	2.61±0.87a
	16 wk	142.13±20.18a	9.52±1.54	1.66±0.32a	0.56±0.25a	2.89±0.69a

^aP<0.05 vs 对照组. ALT: 丙氨酸氨基转移酶; GLU: 空腹血糖; TG: 三酰甘油; HDL-C: 高密度脂蛋白胆固醇; CHOL: 胆固醇.

2.3 HIF-1α、NF-κB在不同程度脂肪肝中的mRNA表达

在高脂饮食后, 随着脂肪肝的进展, HIF-1α mRNA表达逐渐增强(图2A). 同时NF-κB的表达随着高脂饮食的时间延长, 脂肪肝的严重程度的加剧, mRNA表达逐渐升高(P<0.05)(图2B).

图2 不同程度脂肪肝肝中的mRNA表达. A: HIF-1α在不同程度脂肪肝肝中的mRNA表达; B: NF-κB在不同程度脂肪肝肝中的mRNA表达. 1: 对照组; 2: 4 wk组; 3: 8 wk组; 4: 12 wk组; 5: 16 wk组. HIF-1α: 缺氧诱导因子1α; NF-κB: 核因子-κB.

2.4 HIF-1α mRNA与PPARα、NF-κB表达的相关性分析

各组HIF-1α mRNA与NF-κB表达进行Pearson两变量的相关性分析, 结果显示: HIF-1α mRNA表达与NF-κB mRNA具有相关性(r = 0.67, P<0.05).

3 讨论

缺血缺氧在肝细胞的急慢性损伤中的作用日益引起重视, 细胞缺氧也是酒精性肝病的重要特征之一, 但在NAFLD中的研究依然较少, 机制也尚不明确[5,6]. 事实上, 在NAFLD进展过程中, 肝脏对缺血更加敏感. 脂质负荷过重的肝细胞是肿胀的, 尤其在脂肪性肝炎中更为明显. 肿胀性改变会进一步导致肝窦变形及微循环障碍, 血流变慢. 脂肪肝患者的门静脉及肝静脉宽度、血流速度较正常人下降, 在动物模型中, 这样的改变使肝窦的容积下降了近50%[5,7], 从而导致肝细胞处于缺氧状态, 更加容易在氧化应激状态下发生脂质过氧化, 进一步加剧肝细胞的损伤.

缺氧会诱导肝细胞HIF-1α上调, 并进一步调节下游基因参与病理进展, 这在慢性肺病、肿瘤等其他相关疾病研究中已得到大量证实[14]. 但HIF-1α在NAFLD进展过程中究竟扮演着什么角色, 尚不明确.

本研究发现, 随着脂肪肝的进展, HIF-1α表达逐渐增强, 提示HIF-1α可能参与了非酒精性脂肪肝的进展, 但具体机制不清. NF-κB具有促进炎症反应的作用. 已有许多文献证实NF-κB能够促进NAFLD的发生与发展; 且抑制NF-κB能够降低炎症因子的表达, 从而改善NAFLD的进展[15]. 因此, 本研究进一步探讨了NF-κB信号通路在NAFLD中的表达及与HIF-1α表达的关系. 本研究结果表明, NF-κB表达随着高脂饮食的时间延长, 表达逐渐升高(P<0.05). 进一步进行相关分析, 提示HIF-1α表达与NF-κB的表达存在相关性. 但HIF-1α与NF-κB的相互作用关系机制仍需更多的实验研究验证.

总之, HIF-1α通过激活NF-κB可能参与到NAFLD的发生和发展. 提示HIF-1α/NF-κB通路可能成为NAFLD发生与发展的重要分子生物学机制. 抑制非经典HIF-1α/NF-κB通路可能成为治疗NAFLD的新方向.

评论

背景资料

非酒精性脂肪肝病(nonacoholic fatty liver disease, NAFLD)是一种无过量饮酒史, 以肝实质细胞脂肪变性和脂肪贮积为特征的临床病理综合征. 细胞缺氧是酒精性肝病的重要特征之一, 但在非酒精性脂肪肝病中的研究比较少, 机制也不明确.

同行评议者

迟宝荣, 教授, 吉林大学第一医院消化内科

研发前沿

缺血缺氧在肝细胞的急慢性损伤中的作用日益引起重视, 细胞缺氧也是酒精性肝病的重要特征之一. 而缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)和核因子-κB(nuclear factor κB, NF-κB)都是应对细胞组织缺氧反应的关键因子. 但是这两个因子与NAFLD的关系尚不明确, 本文就此进行初步的探讨.

相关报道

缺氧会诱导肝细胞HIF-1α上调, 并进一步调节下游基因参与病理进展, 这在慢性肺病、肿瘤等其他相关疾病研究中已得到大量证实. 但HIF-1α在NAFLD进展过程中究竟扮演着什么角色, 尚不明确. 已有许多文献证实NF-κB能够促进NAFLD的发生与发展; 且抑制NF-κB能够降低炎症因子的表达, 从而改善NAFLD的进展.

创新盘点

细胞缺氧是酒精性肝病的重要特征之一, 已有许多文献证实NF-κB能够促进NAFLD的发生与发展, 但是另一个重要的与缺氧有关关键因子HIF-1α在NAFLD进展过程中究竟扮演着什么角色, 尚不明确, 并且两个因子在NAFLD进展中存在怎样的相互作用也不清楚.

应用要点

初步实验研究发现HIF-1α通过激活NF-κB可能参与到NAFLD的发生和发展, 这提示HIF-1α/NF-κB通路可能成为NAFLD发生与发展的重要分子生物学机制. 抑制非经典HIF-1α/NF-κB通路可能成为治疗NAFLD的新方向.

同行评价

缺血缺氧在NAFLD中的作用是比较值得研究的内容. 作者的研究与此相关, 文章内容具有一定的创新性, 但是本文只是对此进行了初步的探讨, 希望作者能继续进行深入研究, 可以更多的揭示其中的关系, 为治疗NAFLD提供新的思路和方法.

备注

编辑:郭鹏 电编:都珍珍

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