基础研究 Open Access
Copyright ©The Author(s) 2014. Published by Baishideng Publishing Group Inc. All rights reserved.
世界华人消化杂志. 2014-09-18; 22(26): 3891-3897
在线出版日期: 2014-09-18. doi: 10.11569/wcjd.v22.i26.3891
Lin28A/B不同亚型诱导肝癌细胞凋亡的作用
盛金丹, 雷蕾, 王爱平
盛金丹, 王爱平, 北华大学附属医院消化内科 吉林省吉林市 132011
雷蕾, 上海市长海医院儿科 上海市 200433
盛金丹, 住院医师, 主要从事肝癌与Lin28基因相关性的研究.
基金项目: 北华大学教育基金会永大肝病基金资助项目.
作者贡献分布: 王爱平、盛金丹及雷蕾共同完成; 此课题由王爱平与盛金丹设计; 研究过程由王爱平、盛金丹及雷蕾共同完成; 研究所用新试剂及分析工具由王爱平提供; 数据分析由所有作者完成; 本论文由盛金丹与雷蕾写作; 王爱平修正.
通讯作者: 王爱平, 教授, 主任医师, 硕士生导师, 132011, 吉林省吉林市解放中路12号, 北华大学附属医院消化内科. 804563050@qq.com
电话: 0432-62166008
收稿日期: 2014-06-10
修回日期: 2014-07-08
接受日期: 2014-07-28
在线出版日期: 2014-09-18

目的: 探讨Lin28A/B亚型对肝癌细胞凋亡的影响, 揭示其在肝癌发生发展过程中的作用.

方法: Real-time PCR和Western blot分别检测Lin28A/B亚型在肝癌细胞系中的表达变化; Real-time PCR和Western blot检测siRNA分别干扰Lin28A/B亚型后二者在肝细胞癌中的表达; MTT法分别Lin28A/B siRNA转染肝癌细胞48、72 h后对肝癌细胞增殖的影响, FACS检测二者对肝癌细胞凋亡的作用.

结果: Lin28A和Lin28B在肝癌细胞中的表达明显上调(P<0.05; P<0.01), 其中Lin28B在肝癌细胞中表达增加更加明显; siRNA可降低Lin28A/B在肝癌细胞中的表达(P<0.05); Lin28A/B siRNA均可抑制肝癌细胞的增殖, 诱导肝癌细胞凋亡率显著增加, 且随着转染时间的延长而进一步增加(P<0.05; P<0.01); 其中Lin28B siRNA对肝癌细胞的作用优于Lin28A siRNA(P<0.05).

结论: Lin28A/B两种亚型均参与肝癌细胞的发生、发展, 其中Lin28B亚型在诱导肝癌细胞凋亡中起主要作用, 而Lin28A可能起到协同作用.

关键词: Lin28A; Lin28B; 肝细胞癌; 细胞增殖; 凋亡

核心提示: Lin28A/B在肝癌细胞中的表达明显高于正常肝细胞, 通过RNA干扰的方法降低Lin28A/B 的表达均可抑制肝癌细胞增殖、诱导肝癌细胞凋亡. Lin28B亚型在诱导肝癌细胞凋亡中起主要作用, 而Lin28A可能起到协同作用.


引文著录: 盛金丹, 雷蕾, 王爱平. Lin28A/B不同亚型诱导肝癌细胞凋亡的作用. 世界华人消化杂志 2014; 22(26): 3891-3897
Role of Lin28A/B subtypes in apoptosis of hepatocellular carcinoma cells
Jin-Dan Sheng, Lei Lei, Ai-Ping Wang
Jin-Dan Sheng, Ai-Ping Wang, Department of Gastroenterology, Affiliated Hospital of Beihua University, Jilin 132011, Jilin Province, China
Lei Lei, Department of Pediatrics, Changhai Hospital, Shanghai 200433, China
Supported by: the Science Foundation for Yongda Liver Disease of Beihua University Education Foundation.
Correspondence to: Ai-Ping Wang, Professor, Chief Physician, Department of Gastroenterology, Affiliated Hospital of Beihua University, 12 Jiefang Middle Road, Jilin 132011, Jilin Province, China. 804563050@qq.com
Received: June 10, 2014
Revised: July 8, 2014
Accepted: July 28, 2014
Published online: September 18, 2014

AIM: To explore the role of Lin28A/B subtypes in apoptosis of hepatocellular carcinoma (HCC) cells, and to analyze the mechanism of action of Lin28A/B in tumorigenesis of HCC.

METHODS: The mRNA and protein expression of Lin28A/B in HCC cells was detected by real-time PCR and Western blot. After siRNAs targeting Lin28A/B were transfected into HCC cells, the expression of Lin28A/B was detected by real-time PCR and Western blot, cell proliferation was assessed by MTT assay, and cell apoptosis was analyzed by FACS.

RESULTS: Real-time PCR showed that the expression of Lin28A/B mRNAs was up-regulated in HCC cells (P < 0.05; P < 0.01), and the up-regulation of Lin28B was more significant than that of Lin28A. Transfection of Lin28A/B siRNAs decreased the expression of Lin28A/B in HCC cells (P < 0.05). MTT assay revealed that Lin28A and Lin28B siRNAs significantly inhibited HCC cell proliferation (P < 0.05; P < 0.01) and promoted cell apoptosis (P < 0.05; P < 0.01). The effect of Lin28B siRNA on cell proliferation and apoptosis was stronger than that of Lin28A siRNA (P < 0.05).

CONCLUSION: Both Lin28A/B take part in the tumorigenesis of HCC. Lin28B may play a major role in HCC tumorigenesis, while Lin28A may play a subordinate role.

Key Words: Lin28A; Lin28B; Hepatocellular carcinoma; Cell proliferation; Apoptosis


引言

Lin28属于RNA结合蛋白(RNA binding protein, RBP)家族的成员, 具有高度保守性和独特的RNA联结模体, 最早研究起始于Lin28在线虫中的表达, 随后证实Lin28在其他高等物种中也有表达, 且表达方式各自不同, 调节机制各异[1,2]. 在哺乳动物中, 该基因家族目前发现Lin28ALin28B两个同型体(亚型)成员[3,4]. Lin28以多种类型集中表达在人类未分化的细胞中, 从而使分化细胞中相关mRNA的翻译和稳定性受到影响[5-7]. 近期研究显示, Lin28基因是诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPS)的关键调节因子之一, 因此成为研究热点. Lin28通过调节iPS可以参与干细胞的分化调控, 包括分化为神经细胞、生殖细胞等, 从而促进机体代谢, 组织生长发育, 细胞的更新等[8-10]. 然而, 令Lin28更加引人关注的是其与Let-7 miRNA家族的相互作用. RNA结合蛋白Lin28A/B可负向调控Let-7 miRNA家族的生物合成, 促进肿瘤的发生、发展和恶化[2,11]. 研究表明, Lin28高表达可见于横纹肌肉瘤、前列腺癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤[7]. Lin28的表达增加虽在肝癌中也有研究报道[8], 但两个亚型Lin28A和Lin28B在肝癌发生、发展中的具体作用报道少见, 因此本研究通过siRNA分析Lin28ALin28B在对肝癌细胞增殖及诱导肝癌细胞凋亡中的作用, 揭示二者在肝癌发生过程中的作用机制, 为临床确定肝癌潜在治疗靶点提供理论依据.

1 材料和方法
1.1 材料

正常肝细胞株IMH和肝癌细胞株Huh7购自美国ATCC细胞库; 高糖DMEM培养基、胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、青链霉素、二甲基亚砜、MTT粉购自Gibco公司; 胰酶-EDTA消化液购自Sigma公司; RNA提取试剂TRIzol、逆转录试剂盒、SYBR荧光定量试剂购自Invitrogen公司; Lin28A、Lin28B及内参引物合成由上海英骏生物技术公司合成; siRNA Lin28A(100 μmol/L)(cat no. s36195)、Lipofectamine® RNAiMAX及其他转染试剂购自Life Technologies公司; siRNA Lin28B(100 μmol/L)(cat no. s52477)购自Ambion公司; 其他常用试剂购自大连宝生物公司; 酶标仪购自Bio-rad公司; 实时定量PCR仪购自ABI公司; 流式细胞仪购自BD公司; 超净工作台购自苏州苏泰净化设备工程有限公司.

1.2 方法

1.2.1 细胞培养: IMH和Huh7细胞分别置于培养皿中培养, 培养液包括10%胎牛血清, 90%高糖DMEM培养基(含100 U/mL青霉素, 100 μg/mL链霉素), 37 ℃、5%CO2培养箱培养. 隔天换液, 每2-3天传代.

1.2.2 Real-time PCR检测: 采用TRIzol试剂提取IMH和Huh7细胞mRNA, 利用PCR特异引物设计合成cDNA. Lin28A: 上游引物: 5'-CACGCACGCGACTCTGTAAG-3'; 下游引物: 5'-GGATCACCTGGCTCTGTAATA-3'; Lin28B: 上游引物: 5'-AATGCGATGAGCTCTGTATC-3'; 下游引物: 5'-CTAAGTTATGGCTCTGCTTTG-3'; GAPDH: 上游引物: 5'-AGTACCAGTCTGTTGCTGG-3'; 下游引物: 5'-TAATAGACCCGGATGTCTGGT-3'. 对目的基因进行Real-time PCR检测. 反应条件: 50 ℃ 1 min, 95 ℃ 30 s, 56 ℃-60 ℃ 50 s, 72 ℃ 35 s, 共35个循环. GAPDH为参照, 数据收集主要由荧光定量PCR反应仪软件计算出所有标准品和样品的起始循环数(Ct), 并且根据标准品Ct值绘制出标准曲线, 再根据2-△△Ct法进行定量分析.

1.2.3 细胞转染: 转染试剂使用Lipofectamine RNAiMAX Reagent, 根据转染体系说明进行Lin28A siRNA和Lin28B siRNA转染. 接种Huh7细胞于6孔板, 至60%-80%融合开始转染, Lin28A siRNA和Lin28B siRNA和转染试剂分别用Opti-MEM稀释, 并室温孵育5 min, 将配制好的转染体系(siRNA-Reagent复合物)100 μL加入孔板中, 使siRNA终浓度达到5 nmol/L.

1.2.4 Western blot检测: 裂解全细胞, 将处理好的细胞裂解液加入蛋白上样缓冲液, 95 ℃加热5 min, 10%SDS-PAGE蛋白电泳分离样品, 并转移至硝酸纤维膜, 5%脱脂奶粉室温封2 h, 以去除非特异性背景, 4 ℃一抗孵育过夜, PBST洗涤, 加入相应兔二抗, 室温避光孵育30 min, PBST洗涤, ECL显色, X片曝光成像.

1.2.5 MTT检测细胞增殖率: 将Huh7细胞Lin28A siRNA和Lin28B siRNA转染48、72 h后及对照组细胞消化、计数, 以3000个/孔接种于96孔板, 同时每孔加入MTT溶液(5 g/L)20 μL, 温箱内培养4 h, 弃培养液, 加入DMSO 150 μL/孔, 摇床振荡10 min, 至紫色结晶充分溶解后, 置酶标仪于492 nm波长处测定其吸光度(A)值, 计算细胞增殖率(%) = (A实验组/A溶剂对照组-1)×100%. 每组均设5个复孔, 实验重复3次.

1.2.6 流式细胞仪检测细胞凋亡: 取Huh7细胞Lin28A siRNA和Lin28B siRNA转染72 h后, 用0.25%胰酶收集所有细胞, 用4 ℃预冷的PBS(0.1 mol/L, pH 7.4)洗涤1次, 计数细胞并调整细胞数约为1×106/mL. 根据Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒提供的方法进行处理细胞: 加入500 μL的Binding Buffer悬浮细胞; 加入5 μL Annexin V-FITC混匀; 再加入5 μL PI, 轻轻混匀; 避光, 室温放置15 min. 1 h内用流式细胞仪检测细胞凋亡, 激发波长为488 nm, 发射波长为530 nm. 所得数据用FCSExpress3.0软件进行分析.

统计学处理 所有数据均以mean±SD表示. 数据统计分析及处理均用SPSS16.0软件. 多组样本均数的比较应用单因素方差分析, 两样本均数的比较选择t检验. P<0.05为差异有统计学意义.

2 结果

2.1 Lin28A和Lin28B在肝癌细胞中的表达应用Real-time PCR检测Lin28A和Lin28B两个基因在肝癌细胞中的表达变化. 与正常肝细胞比较, Lin28A在肝癌细胞中表达明显增加, 表达增加近3倍, 差异具有统计学意义(P<0.05)(图1A). 而Lin28B在肝癌细胞中表达亦显著增加, 与正常对照组比较, 表达增加近5倍, 差异具有统计学意义(P<0.01)(图1B). 利用Western blot检测Lin28A和Lin28B蛋白在肝癌细胞中的表达变化. 与基因表达相似, Lin28A在肝癌细胞中表达明显增加, 而Lin28B在肝癌细胞中表达亦显著增加(图2).

图1
图1 Lin28ALin28B mRNA在肝癌细胞中的表达变化. A: Lin28A在肝癌细胞和正常细胞中的表达变化; B: Lin28B在肝癌细胞和正常细胞中的表达变化. aP<0.05, bP<0.01 vs 正常肝细胞组.
图2
图2 Western blot检测Lin28A和Lin28B在肝癌细胞中的表达变化. A: Lin28A; B: Lin28B.
2.2 siRNA抑制Lin28A和Lin28B在肝癌细胞中的表达

应用Real-time PCR检测分别用Lin28A siRNA和Lin28B siRNA转染Huh7细胞24 h后, Lin28ALin28B基因在肝癌细胞中的表达变化. 结果证实siRNA转染后, 可显著降低Lin28A和Lin28B在肝癌细胞中表达, 差异具有统计学意义(P<0.05)(图3). 进一步, 用Western blot检测Lin28A siRNA和Lin28B siRNA转染Huh7细胞24 h后, Lin28A和Lin28B在肝癌细胞中的表达. 结果可见分别siRNA转染后, 可显著降低Lin28A和Lin28B在Huh7细胞中的表达, 说明Lin28A siRNA和Lin28B siRNA可以成功干扰二者在肝癌细胞系中的表达(图4).

图3
图3 Real-time PCR检测siRNA对Lin28A mRNA和Lin28B mRNA在肝癌细胞中的表达影响. A: Lin28A mRNA的表达变化; B: Lin28B mRNA的表达变化. aP<0.05, bP<0.01 vs 对照组.
图4
图4 Western blot检测siRNA对Lin28ALin28B在肝癌中表达的影响. 1: Lin28A对照组; 2: Lin28A siRNA; 3: Lin28A载体对照组; 4: Lin28B对照组; 5: Lin28B siRNA; 6: Lin28B载体对照组.
2.3 Lin28A siRNA和Lin28B siRNA后对肝癌细胞增殖的影响

利用siRNA技术分别干扰Lin28A和Lin28B在肝癌细胞中的表达, MTT检测转染入肝癌细胞48、72 h后, 二者对肝癌细胞增殖的影响. Lin28A siRNA转染入肝癌细胞48 h后, 肝癌细胞增殖受到明显影响, 与肝癌细胞对照组比较差异具有统计学意义, 且随着转染时间的增长, 对肝癌细胞增殖抑制的作用更加显著(P<0.05). 肝癌细胞转染Lin28B siRNA后, 与肝癌细胞对照组比较, 肝癌细胞的增殖活性受到明显抑制, 具有显著统计学意义, 同样随着转染时间的增加而进一步影响肝癌细胞的增殖(P<0.01). 值得注意的是, 与Lin28A siRNA转染组比较, Lin28B siRNA转染组对肝癌细胞增殖的影响更加明显(P<0.05)(图5).

图5
图5 Lin28ALin28B siRNA对肝癌细胞增殖的影响. aP<0.05, bP<0.01 vs 对照组; cP<0.05 vs Lin28A siRNA.
2.4 Lin28A siRNA和Lin28B siRNA后对肝癌细胞凋亡的影响

流式细胞仪检测细胞凋亡率结果显示, Lin28A siRNA和Lin28B siRNA转染Huh-7细胞48、72 h后, 细胞早期凋亡率逐渐上升, Lin28A siRNA和Lin28B siRNA转染后与对照组比较, 凋亡率显著增加, 差异有统计学意义(P<0.05); 且随着转移时间的延长, 凋亡率增加更加明显; 而且在不同时间点检测结果可见, 与Lin28A siRNA转染组比较, Lin28B siRNA转染组对凋亡的影响更加明显(图6, 图7).

图6
图6 Lin28A siRNA和Lin28B siRNA转染不同时间对肝癌细胞凋亡的影响. A: 肝癌对照组48 h; B: 肝癌对照组72 h; C: Lin28A siRNA转染48 h组; D: Lin28B siRNA转染48 h组; E: Lin28A siRNA转染72 h组; F: Lin28B siRNA转染72 h组.
图7
图7 Lin28ALin28B siRNA对肝癌细胞凋亡的影响. aP<0.05, bP<0.01 vs 对照组; cP<0.05 vs Lin28A siRNA.
3 讨论

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是世界常见的肿瘤之一, 是肿瘤的主要死因之一, 发病率一直居高不下. 找到与肝癌发生密切相关的分子靶点一直以来是预防、诊断、治疗肝癌的新的研究热点[12-14]. 研究发现, 肝癌的发生与细胞周期、细胞分化等密切相关[15,16]. RBP作为能够调控细胞增殖、分化及生长的调节因子, 通过调节RNA剪接、转运、编辑等, 维持RNA细胞内稳定、定位及翻译等正常功能[17-19].

作为RBP家族的重要成员, Lin28蛋白类似于"翻译增强子", 在各细胞以及组织中可通过将RNA和多核糖体的连接, 增强起始复合物的翻译, 提高蛋白的合成[20,21]. 目前, 在包括乳腺癌、肝癌等多种肿瘤细胞中发现Lin28发挥调控细胞分化及细胞周期的作用. 肿瘤细胞中Lin28通过结合众多细胞调节相关基因, 促进细胞周期蛋白如CDK2的翻译, 调控细胞的生长和存活, 从而达到对肿瘤细胞增殖的正反馈作用[22-25]. Lin28可通过转录后抑制Let-7 miRNA的生物合成, 负向调控并阻断Let-7的作用, 促进癌基因的表达. 研究表明Let-7又可将Lin28作为靶点, 通过结合Lin28的转录子, 抑制其表达, 因此Lin28和Let-7相互影响, 构成双向负反馈环路[26,27]. 上述调节机制有利于正常细胞的生长、增殖、发育以及组织内环境的稳定, 如该机制异常则导致炎症, 甚至肿瘤的发生[28-30]. 在近期研究中分别证实了Lin28A/B的两个亚型Lin28A和Lin28B在肝癌细胞中存在过表达[31,32].

本研究表明, 与正常肝细胞比较, Lin28A和Lin28B在肝癌细胞中表达明显上调, 该结果与以往研究报道相似. 值得注意的是, 本研究结果证实Lin28B在肝癌细胞中表达增加较Lin28A更为显著. 进一步通过siRNA分别敲减Lin28A和Lin28B在肝癌细胞中的表达, 证实二者表达减少均可影响肝癌细胞的增殖, 并诱导肝癌细胞的凋亡增加, 尤其在Lin28B siRNA转染肝癌细胞后, 可更加显著地影响肝癌细胞. 上述结果提示Lin28A/B两种亚型均参与肝癌细胞的发生、发展, 是肝癌进展的关键因子, 其中Lin28B亚型与肝癌细胞的增殖关系更为密切, 在肝癌发生中可能起主要作用, 而Lin28A在促进肝癌增殖中可能起到协同作用. 由于Lin28A/B两种亚型在肿瘤细胞中的作用机制和特点各自不同, 因此二者在肝癌中的具体分子机制有待进一步研究.

评论
背景资料

Lin28是RNA结合蛋白家族的重要成员. 通过对干细胞分化的调控, 尤其是对Let-7 miRNA家族的调控, Lin28不仅调节着机体的发育、生长、代谢, 而且在结肠癌、前列腺癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤的发生、发展中同样发挥着重要作用.

同行评议者

魏继福, 研究员, 江苏省人民医院

研发前沿

Lin28在各种肿瘤中的表达、功能、作用机制是当前肿瘤研究领域的重要热点之一. 但Lin28在肝细胞癌中的表达和功能仍未有详细报道.

相关报道

越来越多的研究表明, Lin28可发挥癌基因的功能, 促进了卵巢癌、结肠癌、食管癌、乳腺癌等一系列肿瘤的发生、发展, 是重要的肿瘤患者预后判断标志物和靶向治疗靶点. 在肝细胞癌中, 新近研究同样表明Lin28的表达与肝癌细胞系Hep3B的耐药相关.

创新盘点

本研究首次发现Lin28A和Lin28B在肝癌细胞中的表达明显高于正常肝细胞, 并进一步发现通过RNAi的方法降低Lin28A/B 的表达均可抑制肝癌细胞增殖、诱导肝癌细胞凋亡. 更为重要的是, 本研究初步表明Lin28B亚型在诱导肝癌细胞凋亡中起主要作用, 而Lin28A可能起到协同作用.

应用要点

Lin28A/B在肝癌的发生、发展中发挥重要作用. 一方面, Lin28A/B有可能作为肝癌患者预后判断的分子标志物; 另一方面, Lin28A/B也有可能成为肝癌靶向治疗的分子靶点.

同行评价

本研究致力于Lin28A/B亚型对肝癌细胞凋亡的影响, 从而揭示其在肝癌发生发展过程中的作用.

编辑:郭鹏 电编:闫晋利

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