Smo小干扰RNA对人食管癌CAES-17细胞凋亡的影响

摘要

目的: 探讨Smoothened(Smo)小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)对食管癌的CAES-17细胞的凋亡及凋亡相关基因Bcl-2表达的影响.

方法: Smo siRNA转染食管癌CAES-17细胞, 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测各组食管癌CAES-17细胞中Smo、Bcl-2 mRNA的表达; 采用Western blot检测各组食管癌CAES-17细胞中Smo、Bcl-2的蛋白表达; 采用TUNEL及流式细胞术检测CAES-17细胞的凋亡情况.

结果: 与各对照组相比, Smo siRNA转染细胞24、48和72 h Smo、Bcl-2蛋白及mRNA的表达均明显降低, 其中Smo siRNA的mRNA转录水平为0.524±0.011、0.422±0.008和0.332±0.019; Bcl-2 mRNA的转录水平为0.571±0.024、0.512±0.017和0.492±0.011, 具有明显下调(P<0.05); 转染72 h后, Smo siRNA和Bcl-2蛋白翻译水平与对照相比, 分别为0.330±0.016和0.391±0.019, 差异均有显著性(P<0.05); 各实验组凋亡细胞数与对照组相比均明显增多(P<0.05).

结论: Smo siRNA可能通过抑制CAES-17细胞中Smo基因表达, 进而下调Bcl-2表达, 促进CAES-17细胞凋亡.

关键词: Smo基因; Bcl-2基因; 食管癌CAES-17细胞; 凋亡

核心提示: Smoothened(Smo)小干扰RNA(small interfering RNA)可能通过抑制CAES-17细胞中Smo基因表达, 进而下调Bcl-2表达, 促进CAES-17细胞凋亡. 为食管癌的治疗提供临床参考价值.

Transfection with small interfering RNA targeting smoothened promotes cell apoptosis in human esophageal carcinoma cell line CAES-17

Shan Liu, Zhuo Zhang, Tian-You Chen

Shan Liu, Zhuo Zhang, Tian-You Chen, Department of Thoracic Surgery, the Third Hospital of Wuhan, Wuhan 430060, Hubei Province, China

Correspondence to: Shan Liu, Resident Physician, Department of Thoracic Surgery, the Third Hospital of Wuhan, 241 Pengliuyang Road, Wuchang District, Wuhan 430060, Hubei Province, China. huanghun642@126.com

Received: February 28, 2014
Revised: April 15, 2014
Accepted: April 24, 2014
Published online: July 8, 2014

Abstract

AIM: To investigate the effect of transfection with small interfering RNA (siRNA) targeting smoothened (Smo) on the expression of Bcl-2 in esophageal cancer CAES-17 cells.

METHODS: Smo siRNA was transfected into CAES-17 cells. Reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and Western blot were used to detect the levels of Smo and Bcl-2 mRNAs and proteins. TUNEL assay and flow cytometry were used to detect cell apoptosis.

RESULTS: Compared with the control groups, after transfection with Smo siRNA for 24, 48 and 72 h, the levels of Smo mRNA were significantly down-regulated (0.524 ± 0.011, 0.422 ± 0.008, 0.332 ± 0.019, P < 0.05 for all). After transfection with Smo siRNA for 72 h, the levels of Smo and Bcl-2 proteins were also significantly lower compared with the control groups (0.330 ± 0.016, 0.391 ± 0.019, P < 0.05 for all). The number of apoptotic cells was greatly increased after Smo siRNA transfection.

CONCLUSION: Smo gene may play an important role in the apoptosis of esophageal cancer cells. Smo may be used as a novel biomarker for the treatment of esophageal carcinoma.

Key Words: Smo gene; Bcl-2 gene; CAES-17 cells; Apoptosis

0 引言

Hedgehog(Hh)信号通路是调控细胞增殖和组织分化的重要信号通路, Smoothened(Smo)蛋白是Hh信号通路上的膜蛋白, 他是Hh信号通路的转换器, 把细胞外的Hh信号转换成细胞内的Gli信号, 进而激活Hh相应基因Bcl-2等的转录, 影响细胞凋亡[1]. 本研究应用小干扰RNA(small interference RNA, siRNA)沉默Smo基因, 观察其对人食管癌CAES-17中凋亡相关基因Bcl-2表达及细胞凋亡的影响, 为食管癌的基因治疗提供了理论依据.

1 材料和方法

1.1 材料

人食管鳞癌CAES-17细胞株由中国学科学院肿瘤研究所分子肿瘤学国家重点实验室赠送. Lipofectamine^TM 2000及TRNzol试剂盒购自美国Invitrogen公司; Revert AidTM First Strand cDNA Synthesis Kit购自Fermentas公司; Quant cDNA第一链合成试剂盒; Smo、Bcl-2、β-actin引物由上海生工生物工程有限公司合成; RPMI 1640培养液由北京索莱宝科技有限公司提供. TUNEL试剂盒购自瑞士Roche公司. Smo一抗、β-actin一抗及Bcl-2兔抗人多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司. Smo siRNA(包括3条不同的Smo siRNA、阴性对照siRNA、阴性对照FAM-siRNA)由上海吉玛公司合成. 序列如表1.

表1 Smo siRNA试剂盒中siRNA序列.

Smo目的基因	siRNA
Smo siRNA-1	5'-UUUGAAGGAAGUGUGCCAGTT-3'
	5'-CUGGCACACUUCCUUCAAATT-3'
Smo siRNA-2	5'-GGAGUCAUGACUCUGUUCUTT-3'
	5'-AGAACAGAGUCAUGACUCCTT-3'
Smo siRNA-3	5'-GGGACUAUGUGCUAUGUCATT-3'
	5'-UGACAUAGCACAUAGUCCCTT-3'
阴性对照FAM-siRNA	5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'
	5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'
阴性对照siRNA	5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'
	5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'

1.2 方法

1.2.1 细胞培养: 将人食管癌CAES-17细胞于RPMI 1640培养液(含10%胎牛血清, 青霉素100 U/mL, 链霉素100 U/mL), 37 ℃、5%CO₂孵箱内贴壁培养.

1.2.2 转染: 将CAES-17细胞以4.5×10⁵的密度接种于6孔板中, 细胞覆盖率达到30%-50%时进行转染. 将10 µL siRNA加入250 µL无血清无抗生素的RPMI 1640培养液中; 在250 µL无血清无抗生素的培养液中加入5 µL Lipofectamine^TM 2000, 室温孵育5 min后, 把两者轻轻混均, 室温再孵育20 min为了形成siRNA/RNAi-Mate复合物, 逐滴加入孔中, 前后轻轻晃动6孔板使混合均匀. 在37 ℃、5%CO₂培养箱中继续培养, 5 h后更换含血清含抗生素的RPMI 1640培养液.

1.2.3 Smo siRNA转染浓度的筛选: 采用浓度为33、66、99 nmol/L的FAM-siRNA转染人的食管癌CAES-17细胞24 h后, 荧光显微镜下观察, 浓度为99 nmol/L的siRNA转染效率最高, 将99 nmol/L的siRNA作为后续实验浓度.

1.2.4 最佳siRNA序列筛选: 共分6组: Smo siRNA-1组、Smo siRNA-2组、Smo siRNA-3组、无关序列组、转染试剂组、细胞对照组. 在3条特异的序列中筛选抑制效率最好的Smo siRNA-3序列用于后续实验.

1.2.5 细胞分组: 分为4组: Smo siRNA-3组、无关序列组、转染试剂组, 细胞对照组, 在不同的转染时间点上又分3组: 24 h组、48 h组、72 h组.

1.2.6 RT-PCR检测Smo、Bcl-2 mRNA表达: 用TRNzol提取转染后各组总RNA, 用紫外分光光度仪测量A值, 所有A260/280值都在1.9-2.1之间. 按照逆转录合成cDNA试剂盒说明书合成cDNA. Smo上游引物序列为5'-CGCTACCCTGCTGTTATTCTCT-3', 下游引物序列为5'-CAGGTGGAAGTAGGAGGTCTTG-3'; Bcl-2上游引物序列为5'-AACTCGAGTGACAAGCCCGATG-3', 下游引物序列为5'-GTACCACCAGTTGGTTGTCTTTGA-3'; β-actin上游引物序列为5'-CCTAGAAGCATTTGCGGTGG-3', 下游引物序列为5'-GAGCTACGAGCTGCTGCCTGACG-3'. Smo、Bcl-2、β-actin反应条件为: 95 ℃预变性5 min; 95 ℃, 变性30 s, 63 ℃/68 ℃/67 ℃退火45 s, 72 ℃延伸45 s, 共30个循环; 72 ℃终延伸5 min, Smo、Bcl-2、β-actin扩增产物大小为306、201、416 bp. RT-PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳, Alpha多功能凝胶成像系统成像, 用Alpha View软件图像分析, 分别以Smo、Bcl-2与β-actin的电泳条带吸光度(A)值之比来表示Smo、Bcl-2 mRNA的相对表达量.

1.2.7 Western blot法检测Smo、Bcl-2蛋白的表达: 经转染处理过的细胞用胰酶消化离心, 分别收集各组细胞, 并在冰上裂解, 提取各组蛋白质, 采用BCA法用酶标仪在96孔板中测定波长562 nm时的A值, 并绘制标准曲线, 计算蛋白浓度. 用SDS聚丙烯酰氨凝胶电泳分离蛋白, 各组蛋白上样量为55 μg/孔, 蛋白Marker为5 μg/孔, 先100 V, 后120 V恒压电泳, 用半干式电转仪将蛋白转于PVDF膜上. TBST洗后, 用含5%脱脂奶粉的TBST封闭2 h. PVDF膜与一抗结合Smo和Bcl-2、β-actin抗体(1:1000稀释), 在4 ℃反应过夜, TBST洗过之后, 二抗结合(1:5000稀释)室温孵育1 h, TBST洗过之后, 用二氨基联苯胺(DAB)显色. 用Alpha多功能凝胶成像系统采集图像, 用Alpha View软件分析, 用目的条带与β-actin的A值之比来表示目的蛋白的相对表达量.

1.2.8 流式细胞仪检测细胞凋亡: 收集转染后各组细胞, 保证每组细胞密度>1×10⁶/mL. PBS洗涤3遍, 用100 μL预冷的1×Binding Buffer重悬细胞, 加入5 μL FITC Annexin V和5 μL PI混匀避光孵育15 min, 再加入400 μL 1×Binding Buffer混匀后, 用流式细胞仪检测各组凋亡细胞比例.

1.2.9 原位末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡: 转染处理的细胞爬片, PBS洗3次, 4%多聚甲醛固定20 min, 用中行树胶固定在载玻片上. PBS洗3次, 0.3%TritonX-100冰上通透液30 min; PBS洗3次, 加3%H2O2孵育10 min; PBS洗3次, 把试剂1(Enzyme Solution)50 μL加入到450 μL试剂2(Label Solution)中, 轻轻混匀, 配制成TUNEL反应混合液; 滴加50 μL TUNEL反应混合液37 ℃避光孵预1 h; PBS洗3次, 滴加试剂3(converter-POD)50 μL, 37 ℃避光孵预; PBS洗3次, 用DAB显色, 镜下控制显色时间; 自来水充分冲洗、苏木素复染、1%盐酸乙醇分化、脱水、透明、封片.

统计学处理 采用SPSS17.0统计软件进行统计学处理, 计量结果, 符合正态分布的计量资料采用mean±SD, 多组均数的比较使用单因素方差分析(ANVOA), 对有显著性差异的计量资料, 使用LSD-t检验进行多组均数间的两两比较, 检验水准采取α = 0.05. P<0.05为差异具有统计学意义.

2 结果

2.1 最佳Smo siRNA

3条Smo siRNA(siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3)转染食管癌CAES-17细胞后, 各转染组Smo mRNA表达水平均明显低于各对照组(P<0.05), 其中Smo siRNA-3抑制效率最高(P<0.05). 后续实验采用Smo siRNA-3进行, 各对照组(无关序列组、转染试剂组、细胞对照组)间Smo mRNA的表达差异无显著性(P>0.05)(图1).

图1 各组CAES-17细胞中Smo mRNA的表达. M: DNA Marker; 1: 细胞对照组; 2: 转染试剂组; 3: 无关序列组; 4: Smo siRNA-1组; 5: Smo siRNA-2组; 6: Smo siRNA-3组.

2.2 Smo siRNA-3对CAES-17细胞中Smo及Bcl-2 mRNA表达的影响

Smo siRNA-3转染细胞24、48和72 h与各对照组细胞相比, Smo和Bcl-2 mRNA表达水平均降低, 以转染72 h最为显著, 且各组间差异有统计学意义(P<0.05)(表2, 图2, 图3).

表2 Smo siRNA-3对食管癌CAES-17细胞中Smo mRNA表达的影响 (mean±SD).

分组	Smo mRNA表达量	Bcl-2 mRNA表达量
细胞对照组	0.644±0.023	0.783±0.032
转染试剂组	0.632±0.026	0.790±0.036
无关序列组	0.660±0.035	0.797±0.036
转染Smo siRNA-3后24 h组	0.524±0.011bdf	0.571±0.024bdf
转染Smo siRNA-3后48 h组	0.422±0.008bdfh	0.512±0.017bdfh
转染Smo siRNA-3后72 h组	0.332±0.019bdfhj	0.492±0.011bdfhj
F值	327.87	212.14
P值	<0.01	<0.01

^bP<0.01 vs 细胞对照组;

^dP<0.01 vs 转染试剂组;

^fP<0.01 vs 无序列组相比;

^hP<0.01 vs 转染Smo siRNA-3后24 h组;

^jP<0.01 vs 转染Smo siRNA-3后48 h组.

图2 各组CAES-17细胞中Smo mRNA的表达. M: DNA Marker; 1: 细胞对照组; 2: 转染Smo siRNA-3后24 h组; 3: 转染Smo siRNA-3后48 h组; 4: 转染Smo siRNA-3后72 h组.

图3 各组CAES-17细胞中Bcl-2 mRNA的表达. M: DNA Marker; 1: 细胞对照组; 2: 转染试剂组; 3: 无关序列组; 4: 转染Smo siRNA-3后24 h组; 5: 转染Smo siRNA-3后48 h组; 6: 转染Smo siRNA-3后72 h组.

2.3 Smo siRNA-3对CAES-17细胞中Smo及Bcl-2蛋白表达的影响

Western blot检测结果显示, 与对照组细胞相比, Smo siRNA-3转染细胞24、48和72 h, Smo和Bcl-2 mRNA表达水平均降低, 以转染72 h最为显著, 且各组间差异有统计学意义(P<0.05)(表3, 图4).

表3 Smo siRNA-3对食管癌CAES-17细胞中Smo和Bcl-2蛋白表达的影响 (mean±SD).

分组	Smo蛋白表达量	Bcl-2蛋白表达量
细胞对照组	0.624±0.017	0.671±0.023
转染试剂组	0.622±0.031	0.664±0.028
无关序列组	0.628±0.037	0.651±0.030
转染Smo siRNA-3后72 h组	0.330±0.016bdf	0.391±0.019bdf
F值	151.31	180.20
P值	<0.01	<0.01

^bP<0.01 vs 细胞对照组;

^dP<0.01 vs 转染试剂组;

^fP<0.01 vs 无序列组相比.

图4 Smo siRNA对食管癌CAES-17细胞Smo蛋白和Bcl-2蛋白表达的影响. 1: 细胞对照组; 2: 转染试剂组; 3: 无关序列组; 4: 转染Smo siRNA-3后72 h组.

2.4 原位末端标记法(TUNEL)检测细胞凋亡的结果

结果显示: 细胞对照组、转染试剂组、无关序列组凋亡指数(apoptotic index, AI)分别为3.00%±1.58%、3.80%±1.92%、4.20%±1.92%, 转染Smo siRNA-3后48 h组细胞凋亡指数为20.40%±3.61%, 转染Smo siRNA-3后48 h组与各对照组相比, 细胞凋亡指数上升有统计学意义(F = 66.27, P<0.05), 各对照组之间比较细胞凋亡指数均无统计学意义(表4, 图5).

表4 Smo siRNA-3对各组食管癌CAES-17细胞凋亡指数的影响 (mean±SD).

分组	凋亡指数
正常对照组	3.00±1.58
转染试剂组	3.80±1.92
无关序列组	4.20±1.92
转染Smo siRNA-3后48 h组	20.40±3.61bdf
F值	66.27
P值	<0.01

^bP<0.01 vs 细胞对照组;

^dP<0.01 vs 转染试剂组;

^fP<0.01 vs 无序列组相比.

图5 Smo siRNA对食管癌CAES-17细胞凋亡的影响(TUNEL×400). A: 细胞对照组; B: 转染试剂组; C: 无关序列组组; D: Smo siRNA-3转染48 h组.

2.5 流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况

Smo siRNA-3转染食管癌CAES-17细胞48 h, 晚期凋亡细胞和早期凋亡细胞所占的比例均明显高于各对照组(均P<0.05), 差异均有统计学意义(均P<0.05)(表5, 图6).

表5 Smo siRNA对CAES-17细胞凋亡的影响 (%, mean±SD).

分组	损伤细胞(Q1区)	晚期凋亡细胞(Q2区)	活细胞(Q3区)	早期凋亡细胞(Q4区)
细胞对照组	6.40±1.25	1.08±0.50	84.26±4.83	3.40±1.18
转染试剂组	5.52±1.45	1.60±0.28	88.96±0.95	2.26±0.32
无关序列组	6.62±2.56	1.68±0.51	86.06±1.23	2.20±0.77
Smo siRNA-3组	5.48±1.83bdf	8.78±0.44bdf	77.22±1.90ace	11.32±1.31bdf
F值		221.61		355.08
P值		<0.05		<0.05

^aP<0.05,

^bP<0.01 vs 细胞对照组;

^cP<0.05,

^dP<0.01 vs 转染试剂组;

^eP<0.05,

^fP<0.01 vs 无序列组相比.

图6 Smo siRNA对食管癌CAES-17细胞凋亡的影响. A: 细胞对照组; B: 转染试剂组; C: 无关序列组组; D: Smo siRNA-3转染72 h组.

3 讨论

Hh信号通路是调控细胞增殖和组织分化的重要信号通路. 近年来的研究表明, 多种肿瘤的发生和发展与Hh信号通路的异常激活及过表达有着密切的关系, 如肺小细胞癌[2,3]、基底细胞癌[4,5]、膀胱癌[6,7]、胰腺癌[8,9]、髓母细胞瘤[10-12]、肝癌[13,14]、前列腺癌[15,16]、胃癌[17,18]、乳腺癌[19-21]等.

Smo基因位于7q31-7q32染色体, 编码一个含有1024个氨基酸的蛋白. Smo基因是原癌基因, Smo蛋白有3个区域: 一个细胞内的羧基端区域、一个细胞外氨基端区域和7个疏水跨膜区_[22]. 当Hh蛋白不存在时, 受体蛋白Ptch抑制Smo蛋白的活性, 进而阻断Hh信号通路[23]. 当Hh蛋白存在时, HH蛋白与Ptch蛋白结合, 解除了对Smo蛋白的抑制, 激活的Smo蛋白可以把细胞外的Hh信号转换成细胞内的Gli信号, 进而激活Hh相应基因的转录, 包括Hhip、ptch、Gli1、cyclinD、Bmi1、Bcl-2等[24].

近年来, 通过抑制Hh信号转导通路关键基因进而抑制肿瘤细胞增殖, 诱导肿瘤细胞凋亡已成为研究热点. 相关研究表明[25-29], 通过siRNA抑制胃癌MGC803细胞、乳腺癌MCF-7细胞、肝癌Huh-7细胞、胰腺癌PANC-1细胞中Smo和Gli1的表达, 可以抑制肿瘤细胞的增殖, 诱导细胞凋亡, 增强对化疗药物的敏感性, 表明Smo可能是肿瘤基因治疗的有效靶点.

本课题组前期研究表明[30,31], Smo在人食管鳞癌组织及裸鼠食管癌移植瘤中高表达, Smo siRNA可通过下调裸鼠食管癌细胞中Smo基因的表达, 进而体内诱导裸鼠食管癌移植瘤细胞的凋亡. 本实验采用3条Smo siRNA(siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3)转染食管癌CAES-17细胞后, 各转染组Smo mRNA表达水平均明显低于各对照组(P<0.05), 其中Smo siRNA-3抑制效率最高(P<0.05). 后续实验采用Smo siRNA-3转染CAES-17细胞后, Western blot及RT-PCR检测结果显示, Smo siRNA-3可有效在蛋白和mRNA水平上显著抑制Smo和Bcl-2的表达. Smo siRNA-3转染细胞24、48和72 h与各对照组细胞相比, Smo和Bcl-2蛋白及mRNA表达水平均降低, 以转染72 h最为显著, 且各组间差异有统计学意义(P<0.05). TUNEL法及流式细胞术检测结果显示在Smo和Bcl-2蛋白、mRNA表达水平下调的同时, 可诱导CAES-17细胞凋亡. 引导细胞凋亡的可能机制是通过Smo siRNA沉默Smo表达, 下调Gli表达, 进而抑制Hh相应基因Bcl-2的转录实现的.

评论

背景资料

食管癌为食道肿瘤, 存在许多亚型. 食道的肿瘤长会导致吞咽困难(dysphagia), 疼痛和不舒服, 并需要通过活组织切片检查做诊断. 小的且没有转移的肿瘤可靠外科手术治疗. 而侵犯性强的肿瘤则须靠化学疗法、放射线疗法或合并使用治疗. 此病的预后要看病症不同的程度而定, 但普遍来说都是极差的.

同行评议者

黄缘, 教授, 南昌大学第二附属医院消化内科, 江西省分子医学重点实验室

研发前沿

RNAi技术的应用, 不仅能大大推动人类后基因组计划(蛋白组学) 的发展, 还有可能设计出RNAi芯片, 高通量地筛选药物靶基因, 逐条检测人类基因组的表达抑制情况来明确基因的功能,并且他还将应用于基因治疗、新药开发、生物医学研究等领域.

相关报道

目前, 国内外相关RNA干扰(RNA interfering, RNAi)用于疾病的治疗已有大量报道, 均充分肯定了RNAi在肿瘤治疗方面的价值, 在临床上具有较高的应用价值.

创新盘点

用RNAi 技术来抑制基因的异常表达, 为治疗癌症、遗传病等疾病开辟了新的途径.

应用要点

在疾病治疗方面, 双链小分子RNA或siRNA已被用于临床测试用于几种疾病治疗, 如老年视黄斑退化、肌肉萎缩性侧索硬化症、类风湿性关节炎、肥胖症等. 在抗病毒治疗方面, 帕金森病等神经系统疾病已经开始初步采用RNA干扰疗法. 肿瘤治疗方面也已经取得了一些成果.

同行评价

构建了一种Smo siRNA作用于食管癌, 研究结果表明, 该系统在食管癌的治疗中疗效显著. 为进一步用于临床提供了理论价值.

备注

编辑:郭鹏 电编:鲁亚静

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