壮药汗衣台配伍组方体外抗乙型肝炎病毒的疗效

摘要

目的: 检测乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)抗原和HBV DNA, 比较壮药汗衣台的复方制剂与单味药在抗乙型肝炎病毒方面的疗效.

方法: 根据壮族民间常用的经验组方, 不同浓度汗衣台及其配伍药分别与体外培养的2215细胞共同孵育, 以XTT方法检测他们对2215细胞的毒性作用, 选择各种药物对细胞无明显毒害的浓度进行组配; 3 d更换一次含药培养液, 9 d后收集上清液; 用ELISA法测定上清液中乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen, HBsAg)和乙型肝炎e抗原(hepatitis B e antigen, HBeAg)含量, 荧光定量PCR法检测上清液中HBV-DNA的分泌.

结果: 复方组对HBsAg抗原的抑制作用稍高于单药组, 但统计学上无显著意义; 中低浓度的复方制剂F3-F5抑制HBeAg以及HBV-DNA分泌的作用明显强于相对应浓度的汗衣台单药组(P = 0.002-0.009; P = 0.038-0.05), 而且抑制HBV-DNA分泌的疗效明显优于高浓度的复方制剂F1-F2(P = 0.048-0.015).

结论: 组方配伍后, 中低浓度的复方制剂抗病毒的综合疗效优于相对应浓度汗衣台单味药及高浓度复方制剂, 各种药物成分相互影响、协同作用, 不仅可以降低单个药物浓度, 而且可以产生叠加增效作用.

关键词: 汗衣台; 复方中药制剂; 2215细胞; 乙型肝炎病毒; 体外

In vitro anti-HBV effect of polyherbal medicine of Chuang herb HanYiTai

Dan Liao, Xue-Lin Duan

Dan Liao, Xue-lin Duan, Guangxi Traditional Medicine University, Nanning 530001, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Supported by: the Natural Science Foundation of Guangxi, No. 2010GXNSFA013198; the Special Program of Chinese Medical Science and Technology of the Traditional Medicine Administration of Guangxi, No. GZKZ09-11; and the Science Research Program of the Department of Education of Guangxi, No. 200810LX002.

Correspondence to: Dan Liao, Associate Physician, Department of Physiology, Guangxi Traditional Medicine University, Nanning 530001, 179 Mingxiu East Road, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China. dan9999@126.com

Received: January 14, 2013
Revised: January 30, 2013
Accepted: February 1, 2013
Published online: March 8, 2013

Abstract

AIM: To compare the effect of polyherbal medicine and single herb of Chuang herb HanYiTai in resisting HBV by detecting HBV antigen and HBV DNA.

METHODS: Different concentrations of HanYiTai and other compounded herbs were co-incubated with 2215 cells in vitro, and their toxic effects were detected by XTT method to determine the safe concentrations of HanYiTai and other herbs. Polyherbal compounds were matched with a variety of intoxic concentrations of herbs. Culture medium was changed once every 3 d, and supernatants were collected 9 d later. The contents of HBsAg and HBeAg in supernatants were measured using ELISA. Meanwhile, the secretion of HBV-DNA was detected using fluorescent quantitative PCR.

RESULTS: The inhibitory effect of polyherbal medicine on the secretion of HBsAg antigen was slightly stronger than that of single HanYiTai group, but the difference was not statistically significant. The inhibitory effect of polyherbal medicine F3-F5 on the secretion of HBeAg and HBVDNA was significantly stronger than that of corresponding concentrations of single HanYiTai (P = 0.002-0.009; P = 0.038-0.05). Polyherbal medicine at low and middle concentrations (F3-F5) showed stronger inhibitory effect on the secretion of HBVDNA than that at high concentrations (F1-F2) (P = 0.048-0.015).

CONCLUSION: Anti-HBV effect of low concentration of polyherbal medicine was better than that of high concentration of polyherbal medicine and corresponding concentration of HanyiTai single herb. The mutual influence and synergy of various pharmaceutical ingredients can not only reduce the concentration of a single drug but also produce a superimposed synergistic effect.

Key Words: HanYiTai; Polyherbal medicine; HepG2215; HBV; In vitro

0 引言

"汗衣台(壮语)", 别称"千里找根"[1], 为防己科植物皱波青牛胆的[Tinospora crispa(L.) Miers]的藤茎[1-3]. 该属植物在印度、泰国等东南亚国家被广泛药用, 是印度阿育吠陀医学中最重要的药物之一[4,5]. 据文献记载汗衣台具有通关通窍通脉、通经活血、清热排毒、消炎止痛等作用, 多用于治疗跌打骨折刀伤、痢疾腹胀、痈疖肿毒等. 研究发现该属植物还具有降血糖[6], 降血压[4], 抗增殖[5]等活性. 而广西壮族民间流传其对慢性乙型肝炎具有良效, 我们的前期研究[7]首次证实壮药汗衣台在体外具有抗乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)作用, 阐明了广西民间医用的科学性. 为进一步深入研究汗衣台, 本实验根据壮族民间常用的治疗慢性乙型肝炎的经验组方对汗衣台进行初步的组方配伍探索研究, 以比较其复方制剂的疗效是否高于单味药, 现报道如下.

1 材料和方法

1.1 材料

壮药汗衣台由壮族民间灵芝草药堂提供, 其他药材如白花蛇舌草等由一般药店提供. 各种生药, 各50 g, 分别置于烧杯中, 加适量蒸馏水浸泡30 min后煎煮, 沸后用文火煮30 min, 滤出煎液, 共煎3次, 合并滤液, 浓缩至生药含量0.5 g/mL, 16 000 r/min离心10 min, 取上清液调pH值为7.5, 一次性0.22 μm滤器过滤分装后置4 ℃冰箱保存备用. 细胞HBV-DNA转染的人肝癌细胞HepG2215细胞系购自中南大学湘雅中心实验室细胞库. 胎牛血清(美国Gibco公司), DMEM培养基(HyCone公司), 0.25%DEPC胰酶(上海吉泰科技有限公司), HBV-DNA荧光定量PCR试剂盒(上海科华生物工程有限公司, 批号20071016); 乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen, HBsAg)、乙型肝炎e抗原(hepatitis B e antigen, HBeAg)检测试剂盒(上海科华生物工程公司); XTT检测试剂盒(碧云天). ABI7500 Fast Real-Time PCR仪(美国ABI公司); CO2孵箱(美国Thermo Forma公司); 酶标仪(Bio-Rad); 24孔板(美国Corning公司); 离心机(effend); 0.22 μm滤器(millipore).

1.2 方法

1.2.1 细胞培养: 2215细胞以DMEM培养基(含10%胎牛血清)培养于培养瓶中, 置37 ℃、5%CO2孵箱中生长, 待细胞生长至70%-80%时, 用0.25%胰酶消化5 min, 用吹打管将贴壁的细胞吹打成悬液, 按适当比例分瓶继续培养, 4-5 d传代1次. 每次换液时, 检测上清液HBsAg、HBeAg和HBV-DNA分泌情况, 待表达稳定后开始实验.

1.2.2 细胞毒性实验: 2215细胞用胰酶消化后, 轻轻吹打使成单细胞悬液, 细胞计数后调节细胞浓度至1×10⁵ cell/mL, 按100 µL/孔接种于96孔板中, 置37 ℃、5%CO2培养箱中培养过夜, 待贴壁后吸去上清, 分别加入100 μL含终浓度为1000 μg/mL、900 μg/mL、800 μg/mL、700 μg/mL、600 μg/mL、500 μg/mL、400 μg/mL、300 μg/mL、200 μg/mL、100 μg/mL、50 μg/mL、5 μg/mL、1 μg/mL的汗衣台、补血署、白花蛇舌草、鸡骨草、芦根、黄栀子、土茯苓、杨桃根各个单味药的DMEM培养液, 每个浓度重复5孔, 同时设无药细胞对照组及空白对照组. 培养72 h后滴加新鲜配制的XTT和PMS混合应用液, 继续培养4 h, 在450 nm波长测定吸光度(A)值. 按公式计算细胞存活率{细胞存活率 = [(A实验孔-A空白对照)/(A细胞对照-A空白对照)]×100%}.

1.2.3 配伍药的选择以及复方制剂的配伍方法: 根据壮族民间流传的治疗慢性乙型肝炎常用的经验组方(汗衣台、补血署、白花蛇舌草、鸡骨草、芦根、黄栀子、土茯苓、杨桃根)为依据, 由于民间用药量大多随个人意愿, 参差不齐, 我们只能依据细胞毒性试验结果, 选择各种药物对细胞无明显毒害的浓度范围进行组配. 各种药物的最高无毒浓度混合组成复方一(F1); 约1/1.6最高无毒浓度组成复方二(F2); 1/4最高无毒浓度组成复方三(F3); 约1/8最高无毒浓度组成复方四(F4); 约1/80最高无毒浓度组成复方五(F5).

2 结果

2.1 汗衣台及其配伍药对2215细胞的毒性作用

由于实验原则上只选择对HepG2215细胞无明显毒性作用(即细胞存活率超过85%)的药物浓度为实验用药浓度, 并依此决定配伍组方的药量, 故XTT实验结果仅显示细胞存活率超过85%的药物最高浓度(表1, 表2).

表1 汗衣台、配伍药对2.2.15细胞的毒性作用 (mean±SD).

分组	浓度(μg/mL)	A值	细胞存活率(%)
细胞对照		1.408±0.018	100.0
空白对照		0.409±0.025
汗衣台	800	1.278±0.030	90.8
补血署	100	1.265±0.167	85.7
白花蛇舌草	100	1.262±0.033	85.4
鸡骨草	300	1.329±0.027	92.1
芦根	200	1.360±0.113	95.2
黄栀子	100	1.292±0.062	88.4
土茯苓	200	1.328±0.084	90.2
杨桃根	100	1.284±0.103	87.6

由表1可以得出表2.

表2 复方制剂的组方配伍浓度分布 (μg/mL).

	F1	F2	F3	F4	F5
汗衣台	800	500	200	100	10.0
补血署	100	63	25	13	1.3
白花蛇舌草	100	63	25	13	1.3
鸡骨草	300	200	75	40	3.0
芦根	200	125	50	25	2.5
土茯苓	200	125	50	25	2.5
黄栀子	100	63	25	13	1.3
杨桃根	100	63	25	13	1.3

2.2 汗衣台及其复方制剂对HBsAg、HBeAg分泌的影响

从表3可知, 无论是单药组[7]和复方组均可明显抑制HBsAg、HBeAg的分泌, 且呈剂量依赖. 复方组对HBsAg抗原的抑制作用稍高于相对应浓度的汗衣台单药组, 但统计学上无显著差异; 中低浓度复方制剂F3-F5抑制HBeAg分泌的作用明显强于相对应浓度的单药组(P = 0.002-0.009), 显示中低浓度的配伍组合可以产生良好的抑制病毒e抗原分泌的疗效.

表3 各组药物对2.2.15细胞分泌HBsAg、HBeAg 的抑制作用比较 (mean±SD).

分组	浓度(μg/mL)	HBsAg		HBeAg
		A值	抑制率(%)	A值	抑制率(%)
汗衣台组	800	1.937±0.095b	43.3	0.663±0.032b	80.2
	500	2.015±0.187b	40.9	0.780±0.015b	76.5
	200	2.813±0.169a	16.7	1.246±0.087b	61.7
	100	3.019±0.071a	10.5	1.586±0.189b	50.9
	10	3.158±0.017a	6.3	2.352±0.110b	26.5
复方组	F1	1.732±0.084b	49.5	0.605±0.057b	82.1
	F2	2.322±0.105b	31.6	0.737±0.004b	77.9
	F3	2.654±0.042b	21.5	0.736±0.042bd	77.9
	F4	2.712±0.075b	19.8	0.928±0.053bd	71.8
	F5	2.925±0.124a	13.3	1.346±0.076bd	58.5
阳性对照组		3.364±0.044		3.187±0.012
阴性对照组		0.068±0.020		0.040±0.009

^aP<0.05,

^bP<0.01 vs 阳性对照组;

^dP<0.01 vs 相对应浓度汗衣台组.

2.3 汗衣台及其复方制剂对HBV-DNA分泌的影响

比较汗衣台及其复方制剂对HBV-DNA分泌的影响, 从表4可知, 各浓度汗衣台及其复方制剂均可明显抑制HBV-DNA的分泌(P = 0.042-0.000); 中低浓度复方制剂(F3-F5)对HBV-DNA分泌的抑制效果则明显优于相对应浓度的汗衣台单味药(P = 0.038-0.05); 另外, 高浓度复方制剂(F1-F2)对病毒的抑制作用不及低浓度(F3-F5)(P = 0.048-0.015), 类似前期研究中干扰素出现的情况. 提示中低浓度的单味药组合, 一方面可以降低药物对细胞的毒性作用, 另一方面仍具有很高的抗病毒活性.

表4 汗衣台及其复方制剂对2.2.15细胞分泌HBVDNA的影响 (mean±SD).

分组	浓度(μg/mL)	HBV-DNA拷贝数(×105)	抑制率(%)
汗衣台组	800	6.885±1.352b	77.2
	500	7.299±1.083a	75.8
	200	17.143±3.905a	43.2
	100	13.723±6.494a	54.5
	10	17.215±5.629	42.9
复方组	F1	16.408±0.743a	45.6
	F2	15.945±3.584a	47.2
	F3	5.730±1.041bce	81.0
	F4	4.282±1.413bce	85.8
	F5	7.348±1.814bce	75.7
阳性对照组		30.171±0.577

^aP<0.05,

^bP<0.01 vs 阳性对照组;

^cP<0.05 vs 相对应浓度汗衣台组;

^eP<0.05 vs F1-F2.

3 讨论

对壮药汗衣台的前期研究表明[7], 短期内, 中高浓度的汗衣台抑制2215细胞分泌HBsAg及HBeAg抗原的作用优于干扰素和拉米夫定, 而对HBV-DNA的抑制作用不如拉米夫定, 但强于干扰素. 首次证实汗衣台具有体外抗HBV作用, 阐明了广西民间流传医用的科学性.

为进一步深入研究汗衣台, 本实验对汗衣台进行初步的组方配伍探索研究, 根据壮族民间流传的治疗慢性乙型肝炎常用的经验组方(汗衣台、补血署、白花蛇舌草、鸡骨草、芦根、黄栀子、土茯苓、杨桃根)为依据, 各药物均以无明显细胞毒性的浓度决定配伍组方的用量, 并采用HepG2215细胞为体外细胞模型, 分别给予不同浓度的汗衣台及其相对应浓度的复方制剂相互作用, 以比较其复方制剂的抗病毒疗效是否高于单味药. 实验结果表明, 组方配伍后, 中低浓度复方制剂具有明显的抑制HBeAg以及HBV-DNA分泌的作用, 其疗效不仅明显优于相对应浓度的汗衣台单味药, 而且对于HBV-DNA分泌的抑制作用强于高浓度的配伍组, 类似前期研究中干扰素出现的情况, 提示配伍组方可以改变汗衣台的抗病毒疗效, 使其在较低浓度仍具有很高的抗病毒活性. 由此可以得出结论: 组方配伍后, 各种药物成分相互影响、协同作用, 不仅可以降低单个药物对细胞的毒性, 而且可以产生明显的叠加增效作用.

复方中药制剂的有效成分比单味药复杂得多, 需考虑药物各有效成分之间的相互影响. 现代复方中药制剂的药代动力学研究表明[8,9], 不同的药物经过适当的配伍, 确实可以起到协同增效的作用, 比如口服甘草加芍药煎剂, 血清中的甘草次酸浓度比单服甘草煎剂明显提高, 是由于芍药增加了甘草次酸的吸收和延缓了其排泄的结果, 表明芍药对甘草具有协同增效的作用[10-12]. 在我们的组方配伍药中, 白花蛇舌草经大量实验证实具有增强机体细胞免疫和体液免疫等作用[13,14], 目前已成为临床上比较常用的一种抗病毒、抗肿瘤中草药; 补血署[15]是广西民间常用的一种用于消肿止痛止血的草药; 鸡骨草对急性黄疸型肝炎有良效[16]等. 虽然在此方中各药物成分之间的相互作用尚不明了, 但从抗HBV的效果而言, 广西民间流传的这一经验用方尚属搭配合理.

众所周知, 慢性乙型肝炎的抗病毒治疗是一个长期而艰巨的过程, 除了直接或间接地对抗病原之外, 机体免疫功能的强弱亦是一个能左右疾病进展的关键因素, 干扰素的抗病毒初期疗效虽不如拉米夫定一般立竿见影, 但干扰素的作用稳定、作用面广、作用机制多样化等决定其远期疗效优于拉米夫定[17,18]. 汗衣台对HBV的抑制作用呈剂量依赖性, 但其复方制剂却与干扰素有着类似的表象, 推测汗衣台及其复方制剂除了直接地抑制病毒之外, 可能也具有类似干扰素一样的免疫调节作用, 其整体效应、远期疗效以及作用机制有待进一步的深入研究.

评论

背景资料

中医药及民族医药在治疗慢性乙型肝炎上历史悠久, 各种复方制剂的搭配与选择都是劳动人民智慧的长期结晶, 对古方、验方、秘方的研究发现复方中药在人体内具有广泛的治疗作用, 不仅具有抗病毒作用, 还能调节机体活动.

同行评议者

杨江华, 副教授, 皖南医学院弋矶山医院感染科

研发前沿

通过体外抗乙型肝炎病毒(HBV)试验研究以及HBV感染实验模型筛选出大量的抗HBV中草药以及复方制剂, 但是对抗HBV的有效成分、活性部位及作用机制等核心问题仍然不十分明确.

相关报道

目前对抗HBV中草药的筛选工作以及疗效研究都能应用2215细胞作为研究工具, 检测包括病毒s抗原和e抗原以及病毒基因在内的比较敏感和特异的指标, 结果比较可靠和具有说服力.

创新盘点

本实验在检测了8味单药的最高无毒浓度以后, 按浓度梯度的方式组成各复方制剂的浓度, 虽与实际的用量有较大的差异, 但更显规范与合理.

应用要点

复方汗衣台体外抗HBV综合疗效优于汗衣台单味药, 阐明了广西壮族民间流传的这一经验用方尚属搭配合理, 作为抗HBV药物具有一定的应用前景, 值得进一步研究、开发和利用.

名词解释

阿育吠陀: 印度语, 生命的科学. 根据她的观点, 人类应该与自然界和谐共存, 而疾病的产生是由于这种和谐被打破. 通过利用自然界及其产物恢复这种基本平衡是阿育吠陀医学的主要目的.

同行评价

本文设计较为合理, 具有一定创新性, 对探讨中药治疗慢性乙型肝炎进行了新的探索, 有一定指导意义.

备注

编辑: 田滢 电编: 鲁亚静

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