骨桥蛋白在肝纤维化组织中的表达及其与肝星状细胞活化的关系

摘要

目的: 探讨骨桥蛋白(osteopontin, OPN)在肝纤维化组织中的表达及其与α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)转化生长因子(transforming growth factor beta 1, TGF-β1)的相关性, 了解OPN与肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSC)活化的关系.

方法: 健康♂SD大鼠40只, 随机分成正常对照组和四氯化碳(carbon tetrachloride, CCl₄)诱导的肝纤维化模型组. 于造模2、4、6 wk末分批处死动物, 分别采用RT-PCR和Western blot、免疫组织化学方法联合检测OPN、α-SMA及TGF-β1在肝纤维化组织中的表达.

结果: 正常对照组肝脏组织中OPN、α-SMA及TGF-β1均有极少量表达, CCl₄注射2 wk后, OPN、α-SMA、TGF-β1表达开始增强, 2、4、6 wk肝组织中的表达强度呈明显递增趋势(P<0.05), OPN与α-SMA及TGF-β1表达均呈显著相关(r = 0.625、0.587, P<0.05).

结论: OPN的阳性表达随着肝纤维化程度的加重而增强. 在肝纤维化过程中OPN可能参与了HSC活化以及细胞外基质(extracellular matrix, ECM)合成.

关键词: 肝纤维化; 骨桥蛋白; 肝星状细胞; α-平滑肌肌动蛋白; 转化生长因子β1

核心提示: 本结果表明, 正常肝组织α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)、骨桥蛋白(osteopontin, OPN)微量表达, 而随着CCl₄注射时间的延长, 肝纤维化程度的加重, α-SMA、OPN的表达均逐步增强, 至6 wk时达到高峰. 统计学结果表明, OPN与α-SMA在肝组织中的表达均同步增加, 两者呈显著动态相关. α-SMA被认为是HSC激活的标志, 提示OPN可能与HSC的活化有关.

Correlation between expression of osteopontin and activation of hepatic stellate cells in hepatic fibrosis

Wen-Ling Dai, Hai-Feng Huang, Cui-Hua Lu

Wen-Ling Dai, Department of Intensive Care Unit, the First People's Hospital of Yancheng City, Yancheng 224000, Jiangsu Province, China

Hai-Feng Huang, Department of Laboratory Medicine, Zhenyang Hospital of Yancheng City, Yancheng 224000, Jiangsu Province, China

Cui-Hua Lu, Department of Gastroenterology, the Affiliated Hospital of Nantong University, Nantong 226001, Jiangsu Province, China

Correspondence to: Cui-Hua Lu, Chief Physician, Department of Gastroenterology, the Affiliated Hospital of Nantong University, Nantong 226001, Jiangsu Province, China. lch670608@sina.com

Received: November 6, 2013
Revised: December 3, 2013
Accepted: December 5, 2013
Published online: December 28, 2013

Abstract

AIM: To investigate the expression of osteopontin (OPN) in hepatic fibrosis and explore its correlation with the expression of alpha-smooth muscle actin (α-SMA) and transforming growth factor beta 1 (TGF-β1) as well as the activation of hepatic stellate cells (HSCs).

METHODS: Forty healthy male SD rats were randomly divided into a normal control group and a carbon tetrachloride treatment group. The rats in the treatment group were given a subcutaneous injection of carbon tetrachloride, and sacrificed at weeks 2, 4 and 6 after injection. The mRNA and protein expression of OPN, α-SMA and TGF-β1 was assayed by reverse transcription-polymerase chain reaction, Western blot and immunohistochemistry.

RESULTS: PN, α-SMA and TGF-β1 were slightly expressed in normal liver tissues. After injection of carbon tetrachloride, the expression of OPN, α-SMA and TGF-β1 began to increase at week 2 and was significantly higher at weeks 4 and 6 (P < 0.05), showing a gradually rising trend. The expression of OPN was positively correlated with that of α-SMA and TGF-β1 (r = 0.625, 0.587, both P < 0.05).

CONCLUSION: The expression of OPN, α-SMA and TGF-β1 increases with the development of hepatic fibrosis. OPN probably participates in the activation of HSCs and the synthesis of extracellular matrix (ECM) in the development of hepatic fibrosis.

Key Words: Hepatic fibrosis; Osteopontin; Hepatic stellate cells; α-smooth muscle actin; Transforming growth factor-β1

0 引言

肝纤维化是肝脏对各种慢性肝损伤的代偿反应, 导致细胞外基质(extracellular matrix, ECM)、细胞群和细胞因子的复杂改变[1], 其特征是以胶原为主的ECM各成分因合成增多、降解相对不足而在肝内过量沉积. 骨桥蛋白(osteopontin, OPN)是一种分泌性磷酸化糖蛋白, 广泛分布于各种组织中, 结构上与多种细胞外基质蛋白相似, 功能上具有细胞因子的特点, 在多种疾病的发生发展中起着重要作用. 既往研究显示OPN与肿瘤发生和转移有很大的关系, 近期发现OPN与细胞外基质的分泌和纤维化有关[2,3], 研究还证实OPN参与皮肤肌纤维母细胞的分化和激活, 并能促进伤口愈合[4], 在急性心肌炎病理过程中, OPN的表达水平与心肌纤维化程度相关[5], 这些研究都提示OPN与纤维化发生发展密切相关. 研究证实OPN在肺纤维化和肾纤维化的发生发展中发挥着重要作用. 在肝纤维化的进展过程中可以检测到OPN, 并且其表达与肝纤维化的进程具有相关性. 本研究采用四氯化碳(carbon tetrachloride, CCl₄)皮下注射制备肝纤维化模型, 分别用免疫组织化学、RT-PCR和Western blot联合检测OPN及与肝纤维化密切相关的α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)A及转化生长因子β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)在肝纤维组织中的动态表达, 在进一步了解OPN在肝纤维化发生发展中的意义.

1 材料和方法

1.1 材料

♂Sprague-Dawley大鼠40只, 体质量150 g±20 g, 由南通大学动物实验中心提供; T-PCR两步法试剂盒购自大连宝生物有限公司产品; PCR扩增用引物由上海生工生物工程技术服务有限公司设计并合成; 一抗兔抗大鼠OPN与TGF-β1、α-SMA、二抗均购自武汉博士德生物工程有限公司.

1.2 方法

1.2.1 分组及给药: 用随机抽签法把SD大鼠分为正常对照组和模型组. 正常对照组(n = 8)给予橄榄油溶液3 mL/kg皮下注射, 2次/wk, 共6 wk; 模型(n = 32)分2、4、6 wk组, 给予600 mL/L CCl₄(精制橄榄油配置)3 mL/kg皮下注射, 2次/wk, 每周称体质量1次, 根据体质量调整药物用量.

1.2.2 标本处理: 于造模2、4、6 wk末分批处死大鼠, 大鼠处死时距离CCl₄注射时间为72 h. 第2、4周末分别处死模型组大鼠8只, 正常对照组2只; 第6周末处死模型组大鼠14只(死亡2只), 正常对照组4只. 大鼠处死后, 取出肝脏, 取200 g冷生理盐水灌注冲洗残血后采用液氮快速冷冻并置-80 ℃冰箱中保存待测; 另一部分于40 g/L甲醛固定, 用于免疫组织化学及纤维化组织病理学观察.

1.2.3 RT-PCR检测OPN与α-SMA、TGF-β1 mRNA的表达: 从GenBank查取OPN与α-SMA、TGF-β1基因序列, 以Primer5软件设计引物各一对, OPN: 5'-ACTACAACCATGAGACTGGCAGTGGTTTGC-3', 5'-GAACTCTCTAATTCATGAGAAATGCGGAATTTCAGATAC-3', 片段大小944 bp; α-SMA: 5'- CAGCCAGTCGCCATCAGGAACCT-3', 5'-GGCACGTTGTGAGTCACGCCA-3', 片段大小538 bp; TGF-β: 5'-GCTGCCCGAGGCGGTGCTC-3', 5'-TCTGCAGGCGCAGCTCTGCA-3', 片段大小260 bp; 内参照GAPDH: 5'-AACGACCCCTTCATTGAC-3', 5'-TCCACGACATACTCAGCAC-3', 片段大小191 bp. 上述引物均由上海生工生物技术服务有限公司合成. 采用TRIzol法提取肝组织总RNA, 对样本的定量与纯度分析, cDNA合成, PCR扩增, 产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳, 观察扩增条带.

1.2.4 Western blot检测OPN与α-SMA 、TGF-β1蛋白的表达: 取100 mg肝组织匀浆, 裂解液裂解后蛋白定量, 然后通过SDS-PAGE电泳分离, 硝酸纤维膜转膜后封闭2 h, 分别加入OPN与α-SMA、TGF-β1和β-actin一抗孵育过夜, 加OPN与α-SMA、TGF-β1和β-actin二抗孵育1 h后, 化学发光法显示蛋白条带, 胶片显影、定影.

1.2.5 免疫组织化学检测OPN与α-SMA、TGF-β1的表达: 在高倍镜下, 每张切片随机观察5个高倍视野, 根据细胞着色深度及阳性细胞数分别记分为0-3分, 着色深度以多数细胞呈棕色程度为准. 凡细胞质或腺腔内黏液着浅棕色者为1分、棕色者2分、深棕色者为3分、不着色为0分; 整块切片中阳性细胞占所有细胞中的比例<30%为1分、30%-70%为2分、>70%为3分、无细胞着色为0分. 根据上述2项指标相加的总分分为4级, 0分为阴性(-)、2-3分为弱阳性(+)、4分为阳性(++)、5-6分为强阳性(+++). 4分以上为过表达, 同时设定阴性对照.

统计学处理 所有数据由Stata7.0统计软件进行分析. 免疫组织化学资料采用秩变换方差分析统计和处理. RT-PCR资料采用捷达801分析软件中的凝胶分析软件对条带进行分析, 以各样本的平均积分吸光度值(IA)/各自GAPDH平均积分吸光度值(IA)来表示各目的基因的相对表达强度, 从而对各目的基因表达的强度作半定量分析. P<0.05为差异有统计学意义.

2 结果

2.1 OPN与α-SMA、TGF-β1 mRNA的表达

在肝纤维化模型组, 均扩增出944 bp大小的OPN片段, 正常对照组仅微量表达, OPN mRNA在2、4、6 wk表达逐渐增强, 内参照GAPDH片段大小为191 bp. 经灰度扫描和与内参照比较分析发现, 随着CCl₄注射时间的延长, 肝纤维化程度的加重, OPN mRNA的表达逐渐增强, 到第6周时达到高峰. α-SMA及TGF-β1 mRNA在肝组织中的表达及变化趋势同OPN, 扩增的α-SMA、TGF-β1 mRNA的片段大小分别为538、260 bp, 上述3种mRNA的表达在各模型组与正常对照组表达差异有统计学意义(P<0.05, 图1). 将RT-PCR半定量结果分析后发现, 随着CCl₄注射时间的延长, 肝纤维化程度的加重, 以上3种mRNA的表达逐渐增强, OPN与α-SMA及TGF-β1均有相关性有统计学意义(r = 0.625, 0.587, P<0.05).

图1 OPN、α-SMA、TGF-β1 mRNA在各组中的表达. 1: 正常对照组; 2: 2 wk模型组; 3: 4wk模型组; 4: 6 wk模型组. OPN: 骨桥蛋白; α-SMA: α-平滑肌肌动蛋白; TGF-β1: 转化生长因子.

2.2 Western blot检测OPN与α-SMA及TGF-β1蛋白的表达

OPN蛋白的相对分子质量为66 kDa, 在正常对照组微量表达, 随着CCl₄注射时间的延长, 表达逐渐增强, α-SMA及TGF-β1的分子量分别为42和25 kDa, 表达趋势同OPN蛋白. 经统计学分析, OPN与α-SMA及TGF-β1在各组间的表达差异有统计学意义(P<0.05), 在 6 wk组的表达显著高于正常对照组(P<0.05, 图2)

图2 OPN、α-SMA、TGF-β1蛋白在各组中的表达. 1: 正常对照组; 2: 2 wk模型组; 3: 4 wk模型组; 4: 6 wk模型组. OPN: 骨桥蛋白; α-SMA: α-平滑肌肌动蛋白; TGF-β1: 转化生长因子.

2.3 免疫组织化学检测OPN与α-SMA及TGF-β1的表达

所需组织经由40 g/L甲醛固定, 脱水, 石蜡切片, 脱蜡至水, 自动免疫组织化学染色仪染色, 苏木素复染, 自来水冲洗, 蓝化, 切片经梯度酒精脱水干燥, 二甲苯透明, 中性树胶封固. 正常肝脏组织OPN有微量表达, α-SMA及TGF-β1表达弱阳性. CCl₄注射2 wk后, α-SMA及TGF-β1开始表达, OPN表达增多, 主要分布在中央静脉及窦周细胞; 随着CCl₄注射时间的延长, 以上三者的表达逐渐增强, 主要分布在门静脉、汇管区等纤维增生区域; 到第6周时, 上述3种蛋白质的表达最强. 三者的表达部位相同(图3).

图3 免疫组织化学检测随肝纤维化加重, OPN、α-SMA、TGF-β1的变化(×200). A-D; OPN的表达; E-H: α-SMA的表达; I-L: TGF-β1的表达. OPN: 骨桥蛋白; α-SMA: α-平滑肌肌动蛋白; TGF-β1: 转化生长因子.

3 讨论

肝纤维化是各种原因引起的慢性肝损伤所共有的病理改变, 也是进一步向肝硬化发展的中间环节. 目前已明确HSC的激活和增殖是肝纤维化发生、发展的中心环节[6]. HSC是肝纤维化形成中起关键作用的细胞[7]. 肝纤维化时HSCs可在多种细胞因子及活性氧自由基的作用下激活并转化为肌成纤维细胞, 产生大量以Ⅰ、Ⅲ型胶原为主的细胞外基质, 并分泌TGF-β1、血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor, PDGF)等各种促纤维化因子, 促进肝纤维化的发生和发展. 从本研究结果看, OPN在正常对照组仅微量表达, 而随着CCl₄注射时间的延长, 伴随肝纤维化程度的加重, OPN的表达逐步增强, 提示OPN可能参与了大鼠肝纤维化的形成过程, 其表达水平的上调与肝纤维化的发生和发展有关.

Lenga等[4]研究发现OPN在CCl₄诱导的肝纤维化模型及培养的活化HSC中都高表达; 通过cDNA芯片检测发现, OPN随着HSC活化的进展,表达逐渐升高, 可能OPN的上调表达是HSC活化的一个关键通路[8]. 陈宏辉等[9]在酒精性肝纤维化大鼠模型中, 发现模型组从第4周开始中央静脉和邻近肝窦内皮细胞中OPN的表达即显著上调, 并与胶原纤维面积明显呈正相关. 有研究在博莱霉素诱导OPN缺失的小鼠肺纤维化中发现了OPN缺失的小鼠肺纤维化组织中I型胶原、TGF-β1、MMP-2表达减少[10].

本结果表明, 正常肝组织α-SMA、OPN微量表达, 而随着CCl₄注射时间的延长, 肝纤维化程度的加重, α-SMA、OPN的表达均逐步增强, 至6 wk时达到高峰. 统计学结果表明, OPN与α-SMA在肝组织中的表达均同步增加, 两者呈显著动态相关. α-SMA被认为是HSC激活的标志, 提示OPN可能与HSC的活化有关. Lee等[11]的一项体外研究证实OPN可诱导大鼠肝星状细胞迁移、增殖以及TIMP-2和MT1-MMP的表达, 增加 MMP-2的活性, 激活HSC.

肝纤维化时, TGF-β1通过刺激HSC活化而在ECM的合成及纤维结构的重塑中发挥重要作用[12], TGF-β1是公认的HSC活化最强烈的刺激因子[13,14], 可通过TGF-β1/smad信号传导通路直接激活HSC而形成肝纤维化. 本实验结果也证实, 在大鼠纤维化肝组织中, TGF-β1的表达较对照组明显增加, 随着CCl₄注射时间的延长, 表达逐渐增强. 有研究[11]显示了重组体OPN促进转化生长因子受体TGFβRⅡ的表达, OPN在HSCs中可通过促进TGFβRⅡ的表达而诱导HSC分泌胶原. 另有研究显示OPN能直接诱导TGF-β1 mRNA上调而引起肝纤维化[15]. 本研究相关性分析表明, 随着肝纤维化程度的加重, TGF-β1与OPN的表达呈显著正相关, 结合本实验研究结果, 我们推测, 各种肝损伤因素促发HSC活化并大量表达OPN, 其后OPN上调TGF-β1的水平, 并在其介导下进一步诱导HSC的活化和增殖, 加速肝纤维化的进程. 所以抑制OPN的表达, 有望能抑制HSC的活化, 从而减轻肝纤维化.

评论

背景资料

肝纤维化是各种原因引起的慢性肝损伤所共有的病理改变, 也是进一步向肝硬化发展的中间环节. 目前已明确肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSC)的激活和增殖是肝纤维化发生、发展的中心环节. HSC是肝纤维化形成中起关键作用的细胞. 肝纤维化时HSCs可在多种细胞因子及活性氧自由基的作用下激活并转化为肌成纤维细胞, 产生大量以Ⅰ、Ⅲ型胶原为主的细胞外基质, 并分泌转化生长因子(transforming growth factor beta 1, TGF-β1)、血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor, PDGF)等各种促纤维化因子, 促进肝纤维化的发生和发展.

同行评议者

刘绍能, 主任医师, 中国中医科学院广安门医院消化科

研发前沿

既往研究显示OPN与肿瘤发生和转移有很大的关系, 近期发现OPN与细胞外基质的分泌和纤维化有关, 研究还证实OPN参与皮肤肌纤维母细胞的分化和激活, 并能促进伤口愈合, 在急性心肌炎病理过程中, OPN的表达水平与心肌纤维化程度相关, 这些研究都提示OPN与纤维化发生发展密切相关.

创新盘点

本研究采用CCl₄皮下注射制备肝纤维化模型, 分别用免疫组织化学、RT-PCR和Western blot联合检测OPN及与肝纤维化密切相关的α-SMA及TGF-β1在肝纤维组织中的动态表达, 在进一步了解OPN在肝纤维化发生发展中的意义.

应用要点

各种肝损伤因素促发HSC活化并大量表达OPN, 其后OPN上调TGF-β1的水平, 并在其介导下进一步诱导HSC的活化和增殖, 加速肝纤维化的进程. 所以抑制OPN的表达, 有望能抑制HSC的活化, 从而减轻肝纤维化.

同行评价

本研究设计合理, 结果可靠, 讨论比较丰富, 具有一定的学术价值.

备注

编辑:郭鹏 电编:闫晋利

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