靶向沉默caveolin-1基因对胃癌耐药细胞增殖和迁移影响

摘要

目的: 探讨靶向沉默caveolin-1(cav-1)基因对阿霉素(adriamycin, ADR)诱导的人胃癌耐药细胞SGC7901/ADR增殖和迁移作用的影响及可能机制.

方法: 通过小干扰RNA转染胃癌细胞SGC7901/ADR, 以未转染细胞为正常对照组, 转染siRNA Control为阴性对照组, RT-PCR法检测靶向沉默cav-1基因的效果, MTT法检测各组SGC7901/ADR细胞的增殖能力, Transwell小室迁移实验检测各组SGC7901/ADR细胞的迁移能力, Western blot检测细胞周期相关蛋白Cyclin D1、Cyclin A1和Cyclin E蛋白表达水平.

结果: 靶向沉默cav-1基因显著抑制胃癌SGC7901/ADR细胞增殖, P<0.05; 靶向沉默cav-1基因显著下调细胞周期相关蛋白Cyclin D1和Cyclin A1, 但对Cyclin E无影响; 同时, 靶向沉默cav-1基因显著抑制胃癌SGC7901/ADR细胞迁移能力.

结论: 靶向沉默cav-1基因可抑制胃癌耐药细胞的增殖和迁移, 可能与其抑制细胞周期相关蛋白Cyclin D1、Cyclin A1和迁移相关分子有关.

关键词: caveolin-1基因; RNA干扰; 胃癌; 肿瘤增殖; 肿瘤迁移

核心提示: 靶向沉默cav-1基因可抑制胃癌耐药细胞的增殖和迁移, 可能与其抑制细胞周期相关蛋白Cyclin D1、Cyclin A1和迁移相关分子有关.

Silencing of the caveolin-1 gene inhibits proliferation and migration of multidrug resistant gastric adenocarcinoma cells

Ye Zhang, Xiu-Juan Qu, Yun-Peng Liu, Ling Xu, Ming-Fang Zhao, Ke-Zuo Hou, Yue-E Teng

Ye Zhang, Xiu-Juan Qu, Yun-Peng Liu, Ling Xu, Ming-Fang Zhao, Ke-Zuo Hou, Yue-E Teng, Department of Medical Oncology, the First Hospital of China Medical University, Shenyang 110001, Liaoning Province, China

Supported by: National Natural Science Foundation of China, Nos. 81270036, 30901736, and 81201802; and the Science and Technology Project of Liaoning Province, No. 2013021057.

Correspondence to: Yun-Peng Liu, Professor, Department of Medical Oncology, the First Hospital of China Medical University, 155 Nanjing North Street, Heping District, Shenyang 110001, Liaoning Province, China. cmuliuyunpeng@hotmail.com

Received: August 16, 2013
Revised: October 10, 2013
Accepted: October 17, 2013
Published online: November 18, 2013

Abstract

AIM: To investigate the effect of silencing of the caveolin-1 (cav-1) gene on the proliferation and migration of multidrug resistant gastric adenocarcinoma cells (SGC7901/ADR) and to explore the underlying mechanisms.

METHODS: A siRNA specific for the cav-1 gene was transfected into SGC7901/ADR cells using Lipofectamine 2000. The proliferation and migration of SGC7901/ADR cells were detected by MTT assay and transwell assay, respectively. The mRNA expression of cav-1 was determined by RT-PCR. The protein expression of Cyclin D1, Cyclin A1 and Cyclin E was determined by Western blot.

RESULTS: Compared with the control group, the mRNA expression of cav-1 was significantly decreased in SGC7901/ADR cells after transfection (P < 0.05). The proliferation and migration of SGC7901/ADR cells were inhibited significantly after cav-1 silencing. Additionally, the protein expression of Cyclin D1 and Cyclin A1 was obviously inhibited. However, silencing of cav-1 did not affect Cyclin E expression.

CONCLUSION: Silencing of the cav-1 gene inhibits the proliferation and migration of human gastric cancer SGC7901/ADR cells possibly by decreasing the expression of Cyclin D1 and Cyclin A1.

Key Words: Caveolin-1 gene; RNA interference; Gastric cancer; Proliferation; Migration

0 引言

胞膜窖(caveolae)是细胞质膜向内凹陷所形成的囊状脂筏结构, 广泛存在于各种类型的细胞中, 与细胞胞吞、信号传导、跨膜物质转运等多种细胞功能密切相关. Caveolin-1(Cav-1)是其标志性蛋白, 修饰caveolae的内表面, 关联和富集大量信号分子, 与恶性肿瘤发生发展及化疗耐药相关[1,2]. Cav-1在多种肿瘤中出现异常表达, 但不同肿瘤组织和细胞系Cav-1蛋白表达情况缺乏一致性变化. 目前研究普遍认为, 在肿瘤发生早期Cav-1蛋白表达较低, 以避免其发挥抑制肿瘤发生发展的作用; 随着肿瘤进入快速增殖、转移及耐药阶段, Cav-1蛋白表达明显增加, 以适应新环境及耐受凋亡, 即Cav-1在不同肿瘤的发生发展过程中发挥着不同的作用[3-5]. 本研究旨在通过靶向沉默胃癌耐药细胞SGC7901/阿霉素(adriamycin, ADR)的cav-1基因, 深入探讨cav-1基因与胃癌耐药细胞增殖、迁移的关系, 为寻找新的药物靶标及为个体化用药提供实验依据.

1 材料和方法

1.1 材料

RPMI 1640培养基、胰蛋白酶购自Hyclone公司; 胎牛血清购自天津血研所; 四甲基偶氮唑盐(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)均购自美国Sigma公司; 总RNA抽提试剂TRIzol购自Invitrogen公司; RT-PCR试剂盒购自TaKaRa公司; 鼠抗人Cyclin D1、Cyclin A1、Cyclin E单克隆抗体、兔抗人β-actin单克隆抗体均购自Santa Cruz公司; Transwell小室购自Milliproe公司; 转染试剂Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司; PCR引物合成于大连TaKaRa公司.

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与转染: 人胃癌耐药细胞SGC7901/ADR由中国医科大学肿瘤研究所保存, 在含100 mL/L胎牛血清、12 U/mL庆大霉素的RPMI 1640中, 37 ℃, 饱和湿度及50 mL/L CO₂的孵育箱内传代培养, 取对数生长期细胞进行实验. 实验分3组: 未转染的对照组、转染siRNA control的阴性对照组、转染siRNA cav-1沉默组. 转染方法按Lipofectamine 2000的说明书进行.

1.2.2 Cav-1的siRNA及阴性对照序列的构建: cav-1的RNA干扰序列(siRNA cav-1): 5'-AACCAGAAGGGACACACAGTT-3'; 阴性对照序列(siRNA Control): 5'-AATTCTCCGAACGTGTCACGT-3'[6], 由上海吉玛制药技术有限公司合成.

1.2.3 MTT法检测细胞增殖实验: 取对数生长期的SGC7901/ADR细胞制成单细胞悬液, 以每孔5×10⁴个细胞接种于96孔培养板, 设3个复孔. 实验分3组: 对照组、siRNA Control组、siRNA cav-1组. 37 ℃、50 mL/L CO₂细胞培养箱中培养. 12 h后换无血清RPMI 1640培养液200 μL继续培养12 h, 使细胞周期同步化, 然后换含100 mL/L胎牛血清培养液, 分别再培养24、48、72、96 h后终止培养, 在避光条件下加5 g/L MTT溶液25 μL/孔, 继续孵育4 h后吸弃上清, 加入DMSO 200 μL/孔. 用酶标仪于570 nm波长条件下测定吸光度(A)值. 实验重复3次.

1.2.4 Transwell小室迁移实验: 将Transwell小室置入24孔板中. 收集各组细胞用2.5 g/L胰酶消化, 用无血清的RPMI 1640培养液按5×10⁴个/mL的密度100 μL接种于上室. 吸取含100 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培养液500 μL接种于下室, 置于37 ℃、50 mL/L CO₂的培养箱中培养24 h. 移液器移走Transwell小室的下室和上室内液体, 去除滤膜上层未迁移的胃癌细胞, PBS冲洗滤膜3遍, 甲醇固定, Giemsa染色, 计数穿过微孔移至滤膜下层的细胞数. 共计数中央和四周5个视野, 取平均值.

1.2.5 蛋白印记法(Western blot)检测蛋白表达: 参照我们已发表文献[7], 4 ℃预冷PBS洗涤各组细胞, 收集2×10⁶个, 裂解于100 µL含有蛋白酶抑制剂(1 mmol/L PMSF, 2 µg/mL Aprotitin)的RIPA裂解液中(1%Triton-100, 150 mmol/L NaCl, 10 mmol/L EDTA pH 8.0, 50 mmol/L Tris-HCl pH 7.4, 100 mmol/L NaF, 100 mmol/L Na Vanadate), 超声粉碎(30 J, 5 s/次, 5次), 4 ℃裂解40 min, 4 ℃ 15000 r/min, 离心30 min取上清. 以上步骤均于冰上操作. 采用Lowry法进行总蛋白定量. 以1:2比例与3×样品缓冲液混匀, 煮沸5 min. 将样品(22 µg/lane)在12%的SDS-聚丙烯凝胶中进行电泳2 h. 后通过半干式转印(恒流60 mA 20 min, 后120 mA 15 min)转印到硝酸纤维素膜上, 5%脱脂奶粉封闭2 h, 按预染Marker标记的分子量剪裁转印膜, 一抗(鼠抗人单克隆抗体Cyclin D1 1:500、Cyclin A1 1:500、Cyclin E 1:500、兔抗人单克隆抗体β-actin 1:1000), 4 ℃过夜, 二抗(山羊抗鼠 1:800、山羊抗兔 1:800)室温孵育30 min, 显色、图象采集及分析处理. 实验重复3次.

统计学处理 应用SPSS13.0统计软件进行分析. 各组间计量资料采用mean±SD表示, 各组样本均数的比较采用单因素方差分析, 组间比较采用t检验, P<0.05为差异有统计学意义.

2 结果

2.1 siRNA靶向沉默对SGC7901/ADR细胞cav-1 mRNA表达的抑制作用

RT-PCR检测结果显示, 与对照组和siRNA Control组相比, siRNA cav-1组细胞中cav-1 mRNA的表达水平显著下调(P<0.05)(图1).

图1 siRNA靶向沉默对SGC7901/ADR细胞Cav-1 mRNA表达的抑制作用. A: siRNA靶向沉默对SGC7901/ADR细胞cav-1 mRNA表达的抑制作用; B: RT-PCR产物凝胶电泳条带相对吸光度值的比较. ^aP<0.05 vs SGC7901/ADR组; ^cP<0.05 vs siRNA Control组. ADR: 阿霉素.

2.2 Cav-1靶向沉默对SGC7901/ADR细胞增殖能力的抑制作用

MTT测定细胞生长曲线, 结果显示沉默cav-1基因在72 h和96 h明显抑制SGC7901/ADR细胞的增殖, 与对照组和转染siRNA Control组比较差异有统计学意义(P<0.05, 图2).

图2 siRNA靶向沉默Cav-1对SGC7901/ADR细胞增殖的影响. ^aP<0.05 vs SGC7901/ADR组; ^aP<0.05 vs siRNA Control组. ADR: 阿霉素.

2.3 Cav-1靶向沉默对SGC7901/ADR细胞周期相关蛋白表达的影响

靶向沉默cav-1 48 h后, Western blot检测发现与对照组和siRNA Control组相比, siRNA cav-1组的Cyclin D1和Cyclin A1蛋白表达水平显著下调, 差异有统计学意义(P<0.05, 图3). 而Cyclin E蛋白表达在3组中差异无统计学意义(P>0.05).

图3 siRNA靶向沉默Cav-1对SGC7901/ADR细胞周期相关蛋白Cyclin D1、Cyclin A1和Cyclin E表达的影响.

2.4 Cav-1靶向沉默对SGC7901/ADR细胞迁移能力的影响

体外迁移实验结果显示, 对照组和转染siRNA Control组穿过小室底部小孔的胃癌细胞数无明显差异, 而干扰组穿过小室底部小孔的胃癌细胞数与对照组和转染siRNA Control组相比, 分别下降了65.1%和70.2%, 差异有统计学意义(P<0.05)(图4).

图4 siRNA靶向沉默Cav-1对SGC7901/ADR细胞迁移能力的影响. A: SGC7901/ADR组; B: siRNA Control组; C: siRNA cav-1组; D: 细胞学计数. ^aP<0.05 vs SGC7901/ADR组; ^cP<0.05 vs siRNA Control组. ADR: 阿霉素.

3 讨论

胃癌是一个多基因参与、多阶段变异累积形成的病理过程, 涉及癌基因的活化、抑癌基因的失活、细胞周期的调控失常、转录子异常活化和表遗传学等方面. 作为一种以浸润性生长为特点的恶性肿瘤, 胃癌侵袭和转移途径的多样性导致了其死亡率逐年上升[8]. 研究作为信号传导枢纽的caveolae结构标记蛋白Cav-1与胃癌细胞增殖和迁移的关系, 可以为寻找新的靶向治疗靶点提供思路.

Gao等[9]应用免疫组织化学方法检测发现, 胃癌中Cav-1的表达阳性率为30.2%, 而胃炎中Cav-1的表达为100%, 其中高、中、低分化腺癌组中Cav-1表达无显著差异. 同时采用RT-PCR法检测了胃癌MGC803和BGC823细胞株中cav-1的表达, 发现上述两株胃癌细胞株中cav-1的表达下调, 提示cav-1可能伴随胃癌的发生发展而表达逐步下调. 罗红梅等[10]运用基因重组技术, 将人全长cav-1基因稳定转染至胃癌MGC803细胞中, 发现cav-1转染后的MGC803细胞形态发生明显变化, 胞核变小、胞质丰富、核/质比例降低, 核分裂相少见, 提示cav-1具有诱导分化的作用. Yang等[11]研究发现, 高表达Cav-1使乳腺癌耐药细胞Hs578T/Dox具有更强的生长能力和抗凋亡能力. Burgermeister等[12]认为肿瘤在形成和发展过程中需要不断地适应外界环境, 在化疗耐药阶段, 为适应变化的新环境, 发挥信号传导中枢作用的Caveolae结构和Cav-1蛋白表达会明显增多. 本研究发现cav-1 mRNA在胃癌耐药细胞SGC7901/ADR中过表达, 通过Lipo 2000将cav-1的siRNA转染SGC7901/ADR, 与对照组和转染siRNA Control组比较, cav-1 mRNA表达受到显著抑制. 采用MTT法检测24、48、72和96 h siRNA cav-1对SGC7901/ADR细胞增殖的影响, 结果发现细胞在靶向沉默cav-1 72和96 h后与对照组相比生长明显减缓. 目前研究认为细胞增殖水平主要受细胞周期G₁期调节, 而Cyclin D1、Cyclin A1及Cyclin E主要负责调控G₁/S期的转换[13-15]. 本研究发现, 靶向沉默cav-1 48 h后与对照组和siRNA Control组相比, siRNA cav-1组的Cyclin D1和Cyclin A1蛋白表达水平显著下调, 而Cyclin E蛋白表达在3组中差异无统计学意义, 提示靶向沉默cav-1后, 参与调控细胞周期相关的信号通路受到抑制, 影响G₁期细胞分化能力, 并改变了Cyclin D1和Cyclin A1蛋白对细胞周期的调节作用. 此外, 本研究中靶向沉默cav-1与对照组和siRNA Control组相比, 穿过Transwell底部小孔的数目明显减少, 差异具有统计学意义, 提示靶向沉默cav-1的胃癌耐药细胞SGC7901/ADR的迁移能力受到了抑制. 其原因可能靶向沉默cav-1后影响细胞外基质的降解, 减弱细胞突破基底膜而形成转移灶的能力, 从而可能影响胃癌耐药细胞的迁移、侵袭等运动能力.

总之, 我们通过靶向沉默胃癌耐药细胞SGC7901/ADR细胞中Cav-1的表达, 可抑制其增殖和迁移的生物学特性, 使其恶性程度降低. 本研究对于胃癌耐药细胞的分子靶向治疗提供了新的理论依据.

评论

背景资料

Caveolin-1(Cav-1)与恶性肿瘤发生发展及化疗耐药相关. 目前研究认为, 在肿瘤进入快速增殖、转移及耐药阶段, Cav-1蛋白表达明显增加, 以适应新环境及耐受凋亡.

同行评议者

蒋敬庭, 教授, 常州市第一人民医院(苏州大学附属第三医院)肿瘤生物诊疗中心

研发前沿

本研究通过靶向沉默胃癌耐药细胞SGC7901/ADR的cav-1基因, 深入探讨cav-1基因与胃癌耐药细胞增殖、迁移的关系, 为寻找新的药物靶标及为个体化用药提供实验依据.

相关报道

Yang等发现, 高表达Cav-1使乳腺癌耐药细胞具有更强的生长能力和抗凋亡能力. Burgermeister等证实在化疗耐药阶段, Caveolae结构和Cav-1蛋白表达明显增多.

创新盘点

本研究通过靶向沉默胃癌耐药细胞中Cav-1表达, 抑制其增殖和迁移的生物学特性, 使其恶性程度降低, 为胃癌耐药细胞的分子靶向治疗提供了新的理论依据.

应用要点

靶向沉默cav-1基因可抑制胃癌耐药细胞的增殖和迁移, 为今后恶性肿瘤的分子靶向治疗提供了新的作用靶点.

同行评价

本文探讨了靶向沉默cav-1基因对人胃癌耐药细胞SGC7901/ADR增殖和迁移作用的影响及部分作用机制, 有一定的科学意义.

备注

编辑:郭鹏 电编:闫晋利

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