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世界华人消化杂志. 2013-07-28; 21(21): 2109-2112
在线出版日期: 2013-07-28. doi: 10.11569/wcjd.v21.i21.2109
两种方法检测乙型肝炎患者血清HBV-DNA的应用价值
叶儒军, 郑培锐, 区宇洁, 魏威
叶儒军, 梁平县人民医院检验科 重庆市梁平县 405211
郑培锐, 区宇洁, 中山大学达安基因股份有限公司 广东省广州市 510000
魏威, 南方医科大学生物技术学院 广东省广州市 510515
叶儒军, 主管检验师, 主要从事临床检验方面的研究.
作者贡献分布: 此课题由魏威设计; 研究过程由叶儒军实施完成; 数据分析及病理支持由区宇洁与郑培瑞完成; 本论文写作由叶儒军、魏威及区宇洁共同完成.
通讯作者: 魏威, 讲师, 510515, 广东省广州市广州大道北1838号, 南方医科大学生物技术学院. wwei20052005@163.com
收稿日期: 2013-06-09
修回日期: 2013-07-04
接受日期: 2013-07-15
在线出版日期: 2013-07-28

目的: 观察两种不同方法检测乙型肝炎患者血清中的乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)-DNA的应用价值比较.

方法: 分别使用PCR-EB定性及Amp-lisensor定量法对HBV患者, 乙型肝炎表面抗原(hepatitis B virus surface antigen, HBsAg)与抗-HBs同时阳性、HBsAg阳性、抗-HBs阳性、HBsAg与抗-HBs同时阴性进行血清HBV-DNA检查, 观察2组患者阳性检测率.

结果: B组(HBsAg阳性)患者HBsAg(S/N)值高于A组(P<0.05), C组抗-HBs值高于A组(HBsAg与抗-HBs同时阳性)(P<0.05), Amp-lisensor定量检测下, 患者HBV-DNA阳性率明显高于PCR-EB定性组(P<0.05). Amp-lisensor定量检测中, C组(抗-HBs阳性)患者的阳性检测率最低(P<0.05), 乙型肝炎患者血清中HBV-DNA对数值均有明显的上升, 与E组(乙型肝炎两对半全阴性)比较均有统计学意义(P<0.05). A组与B组HBV-DNA对数值明显高于C组与D组(HBsAg与抗-HBs同时阴性)(P<0.05), A组与B组HBV-DNA对数值比较差异无统计学意义(P>0.05).

结论: Amp-lisensor定量法检测血清HBV-DNA的灵敏度较高, 在抗-HBs阳性患者中仍可以检测到HBV-DNA.

关键词: PCR-EB; Amp-lisensor; 乙型肝炎病毒; 乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸

核心提示: 通过对比PCR-EB定性及Amp-lisensor定量法检查HBV患者血清中HBV-DNA的阳性率以及含量, 阐述两种方法在临床中的应用价值. Amp-lisensor定量法检测血清HBV-DNA的灵敏度较高, 而在抗-HBs阳性患者中仍可以检测到HBV-DNA, 为HBV患者的治疗与预后提供了直接的证据.
引文著录: 叶儒军, 郑培锐, 区宇洁, 魏威. 两种方法检测乙型肝炎患者血清HBV-DNA的应用价值. 世界华人消化杂志 2013; 21(21): 2109-2112
PCR-EB qualitative analysis versus amp-lisensor quantitative assay for detection of HBV-DNA in serum in patients with hepatitis B
Ru-Jun Ye, Pei-Rui Zheng, Yu-Jie Ou, Wei Wei
Ru-Jun Ye, People's Hospital of Liangping County, Chongqing 405211, China
Pei-Rui Zheng, Yu-Jie Ou, Ann Gene Co., LTD, Sun Yat-Sen University, Guangzhou 510000, Guangdong Province, China
Wei Wei, College of Biotechnology, Southern Medical University, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China
Correspondence to: Wei Wei, College of Biotechnology, Southern Medical University, 1838 Guangzhou Road, Guangzhou 510515, Guangdong Province, China. wwei20052005@163.com
Received: June 9, 2013
Revised: July 4, 2013
Accepted: July 15, 2013
Published online: July 28, 2013

AIM: To compare the application value of PCR-EB qualitative analysis versus amp-lisensor quantitative assay in the detection of HBV-DNA in serum in patients with hepatitis B.

METHODS: PCR-EB qualitative analysis or amp-lisensor quantitative assay was used to detect serum HBV-DNA levels in patients with hepatitis B who were positive for both HBsAg and anti-HBs (group A), those positive for HBsAg alone (group B), those positive for anti-HBs alone (group C), or those negative for both HBsAg and anti-HBs (group D). The detection rate of serum HBV-DNA was compared between the two groups.

RESULTS: HBsAg (S/N) value was significantly higher in group than in group A (P < 0.05), and anti-HBs value was significantly higher in group C than in group A (P < 0.05). The detection rate of serum HBV-DNA by Amp-lisensor quantitative assay was significantly higher than that by PCR-EB qualitative analysis (P < 0.05). For amp-lisensor quantitative assay, the positive rate of serum HBV-DNA was lowest in patients of group C (P < 0.05). Serum HBV-DNA rose significantly in patients with hepatitis B. HBV-DNA levels were significantly higher in groups A and B than in groups C and D (all P < 0.05), but showed no significant differences between groups A and B (P > 0.05).

CONCLUSION: Amp-lisensor quantitative assay has a high sensitivity in the detection of serum HBV-DNA and is even able to detect HBV-DNA in patients who are positive for anti-HBs.

Key Words: PCR-EB; Amp-lisensor; Hepatitis B virus; HBV-DNA
0 引言

乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸(hepatitis B virus, HBV-DNA)是反映乙型肝炎患者是否存在HBV复制的一个经典指标, 具有较高的准确性[1]. 目前, 临床上用于HBV-DNA检测的方式方法较多, 从曾经的HBV-DNA的定性检测, 发展为目前HBV-DNA的定量检测[2]. 曾经常用的HBV-DNA检测方式有夹心斑点杂交法、PCR-EB定性检查等[3,4]. 但是临床资料表明, 上述两种检查方法存在阳性检测率低的缺陷. 当前, 对于HBV-DNA检测灵敏度的要求越来越高, 正因如此, Amp-lisensor定量法检测HBV-DNA得到了较大的发展. 与传统的定性检查不同, 其能直接反应病毒复制的程度, 指导临床治疗. 笔者通过对比PCR-EB定性及Amp-lisensor定量法检查HBV患者血清中HBV-DNA的阳性率及含量, 阐述两种方法在临床中的应用价值, 现报告如下.

1 材料和方法
1.1 材料

本研究共纳入研究对象125例, 均为我院2012-01/2012-12门诊或住院治疗的HBV患者或寄往曾明确诊断为HBV的患者. 根据患者检测指标进行临床分组. 其中A组患者为乙型肝炎表面抗原(hepatitis B virus surface antigen, HBsAg)与抗-HBs同时阳性; B组为HBsAg阳性; C组为抗-HBs阳性; D组为HBsAg与抗-HBs同时阴性; E组为乙型肝炎两对半全阴性, 肝功能正常的健康体检者. 各组病例均为25例. HBV临床诊断标准参考2000-2001年《病毒性肝炎防治方案》, 中华医学会传染病与寄生虫病学分会、中华医学会肝病学分会联合修订.

1.2 方法

1.2.1 标本采集: 清晨空腹采取肘静脉血10 mL, 经4 ℃离心机5000 r/min离心15 min分理出血清, -20 ℃冰箱中保存.

1.2.2 HBV 5M检测: 使用1 Mx自动免疫分析仪进行, 采用微粒子酶免分析法HBV 5M试剂盒, 仪器与试剂盒均购自Abbott公司, 实验操作按说明书进行.

1.2.3 PCR-EB定性检测: (1)实验步骤: 将5 μL 25 mmol/L MgCl2加入50 μL血清中, 98 ℃变性15 min, 然后进行离心, 变性裂解液5 μL加入标准反应液15 μL中, 密封94 ℃变性5 min, 进行45个循环. 所有反应在ABI Prism 7300型荧光定量PCR仪(AppliedBiosystems, 美国)上进行.

1.2.4 Amp-lisensor定量法检测: 使用AG-9600荧光检测仪进行检测, 并采用HBV-DNA定量试剂盒以及ASAP软件, 实验操作根据试剂盒说明书进行. 实验设立阴性及阳性对照组以及最大信号对照组, 同时严格参考Kwork等提出的预防污染措施, 阳性截止值≥2×103 copy/mL.

统计学处理 采用SPSS13.0统计软件进行统计分析, 计量资料用mean±SD表示, 计数资料用百分率表示, 组间计量资料比较采用两样本t检验, 组间计数资料的比较采用χ2检验, 以P<0.05为差异具有统计学意义.

2 结果
2.1 各组患者HBV 5M检测结果比较

B组患者HBsAg(S/N)值高于A组(P<0.05), C组抗-HBs值高于A组(P<0.05)(表1).

表1 各组患者HBV 5M检测结果比较 (n = 25, mean±SD).
分组HBsAg(S/N)值抗-HBs值(IU/L)HBeAg抗-HBe抗-HBc
A组: HBsAg与抗-HBs同时阳性 98.3±69.0 92.9±202.4 11 8 25
B组: HBsAg阳性 104.2±73.9a10 8 25
C组: 抗-HBs阳性 115.2±187.1a4 11 25
D组: HBsAg与抗-HBs同时阴性 5 13 25
aP<0.05 vs A组. HBsAg: 乙型肝炎表面抗原; HBV: 乙型肝炎病毒.
2.2 2种方法检测血清HBV-DNA阳性率比较

Amp-lisensor定量检测下, 患者HBV-DNA无论在A、B、C、D组, 阳性率均明显高于PCR-EB定性组(P<0.05). Amp-lisensor定量检测中, C组患者的阳性检测率最低(P<0.05)(表2).

表2 2种方法检测血清HBV-DNA阳性率比较 (n = 25).
分组PCR-EB定性
Amp-lisensor定量
阳性数(n)阳性率(%)阳性数(n)阳性率(%)
A组: HBsAg与抗-HBs同时阳性 17 68.0 23 92.0ac
B组: HBsAg阳性 14 56.0 19 76.0ac
C组: 抗-HBs阳性 6 24.0 13 52.0a
D组: HBsAg与抗-HBs同时阴性 10 40.0 20 80.0ac
总计 47 47.0 75 75.0a
aP<0.05 vs PCR-EB组;
cP<0.05 vs C组. HBsAg: 乙型肝炎表面抗原; HBV: 乙型肝炎病毒.
2.3 Amp-lisensor定量检测各组血清HBV-DNA含量比较

除E组(健康体检者)外, 乙型肝炎患者血清中HBV-DNA对数值均有明显的上升, 与E组比较均有统计学意义(P<0.05). A组与B组HBV-DNA对数值明显高于C组与D组(P<0.05), A组与B组HBV-DNA对数值比较差异无统计学意义(P>0.05)(表3).

表3 Amp-lisensor定量检测各组血清HBV-DNA含量比较 (n = 25, mean±SD).
分组HBV-DNA(对数值)P值
与对照组比较与A组比较与B组比较与C组比较
A组: HBsAg与抗-HBs同时阳性 6.13±1.88 ＜0.05
B组: HBsAg阳性 6.09±1.79 ＜0.05 ＞0.05
C组: 抗-HBs阳性 4.09±1.38 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05
D组: HBsAg与抗-HBs同时阴性 5.08±1.19 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05
E组: 乙型肝炎两对半全阴性 1.99±0.55
HBsAg: 乙型肝炎表面抗原; HBV: 乙型肝炎病毒; HBV-DNA: 乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸.
3 讨论

目前, 临床上用于检测血清HBV-DNA的方法较多, 随着研究的进一步深入以及检验技术的迅速发展, 新的HBV-DNA检查手段不断出现[5]. Zaaijer等[6]曾经使用斑点杂交法、分支链DNA信号扩增、Abbott液相杂交、PCR、Amp-lisensor定量等对HBV患者进行血清HBV-DNA灵敏度的检测. 结果发现, 各组灵敏度分别为2.5×107 copy/mL、2.5×106 copy/mL、2.5×107 copy/mL、2.5×102 copy/mL、50 copy/mL. 提示Amp-lisensor定量对于临床检查HBV患者血清HBV-DNA的灵敏度较高. 本研究对PCR与Amp-lisensor定量两种目前临床虫咬的检验HBV-DNA方法进行了观察, 可以发现, 无论在HBsAg与抗-HBs同时阳性、HBsAg阳性、抗-HBs阳性、HBsAg与抗-HBs同时阴性的患者中, Amp-lisensor检测的阳性检测率均明显高于PCR-EB. 这与Zaaijer等[6]的研究结果较为相似, 说明Amp-lisensor检测在检测HBV-DNA阳性率方面, 具有较高的检查灵敏度.

本研究显示, HBsAg与抗-HBs同时阳性的HBV患者, 和普通的HBV患者一样, 其血清HBV-DNA的含量均较高, 且两组之间无统计学差异. 但是, 在抗-HBs阳性患者以及抗-HBc阳性患者方面, 两组血清HBV-DNA含量明显低于A组与B组. 然而, 进行Amp-lisensor检测可以发现, 两组的HBV-DNA阳性率仍达到52.0%(13/20)、80.0%(20/25), 并且处于阳性截止值之上. 传统的理解认为, 如果HBV感染者血液中抗-HBs出现阳性, 即表示患者体内的HBV病毒被清除, 意味着HBV传染性的消失以及病情好转、康复[7-9]. 但是, 通过本研究的结果, 发现即使抗-HBs出现阳性, 患者血清HBV-DNA含量仍然处于较高水平. 因此, 临床对于该类抗-HBs出现阳性的患者, 需要进行进一步的研究, 重新认识这个问题. 随着检测手段的丰富, 目前临床研究已经发现[10,11], 在一些抗-HBs阳性的HBV患者中, 仍可以在血清或肝脏组织中发现较大量的HBV-DNA. 有学者对1355例HBV慢性携带者进行了跟踪随访检测, 在进行为期23 mo的检查后, 发现有55例患者HBsAg发生自然转阴, 32例患者出现抗-HBs阳性[12]. 对抗-HBs阳性的患者进行进一步观察, 发现有近20%的患者, 血清HBV-DNA检测阳性. 而对55例HBsAg自然转阴的患者进行观察, 能够发现18例患者出现肝癌、肝硬化以及亚急性重型肝炎. 研究认为[13,14], HBsAg自然转阴, 甚至抗-HBs出现阳性, 并不一定属于病情好转的标志, 相反, 在一些患者中, 甚至出现病情恶化的可能. 该情况的发生与体内仍存在一定量的HBV-DNA有关. 因此, 临床上定性检测HBV 5M, 可能存在较大的误差, 影响HBV患者的预后判断. 而Amp-lisensor定量检测恰恰可以弥补各类定性检测方法可能带来的误差, 精准得出患者血清HBV-DNA的含量, 判断是否存在传染性或病情恶化[15]. 该技术与PCR的主要差别在于Amp-lisensor采用的是复合探针. 一个探针上标以荧光报告基团, 另一个探针上标以荧光淬灭基团, 两探针之间能因碱基互补而结合. 此时, 两基团靠近而形成FRET结构, 报告基团的荧光信号被淬灭基团吸收. 当两探针分开后, 其间的FRET关系受到破坏, 淬灭基团的抑制作用解除, 报告基团的荧光信号得到释放. 因此, Amp-lisensor的结果较为可靠, 出现假阳性的情况相对较低.

总之, Amp-lisensor定量法检测血清HBV-DNA的灵敏度较高, 在抗-HBs阳性患者中仍可以检测到HBV-DNA, 为HBV患者的治疗与预后提供了直接的证据.

评论
背景资料

目前, 临床上用于HBV-DNA检测的方式方法较多, 从曾经的HBV-DNA的定性检测, 发展为目前HBV-DNA的定量检测. 曾经常用的HBV-DNA检测方式有夹心斑点杂交法、PCR-EB定性检查等. 但是临床资料表明, 上述2种检查方法存在阳性检测率低的缺陷. 当前, 对于HBV-DNA检测灵敏度的要求越来越高, 正因如此, Amp-lisensor定量法检测HBV-DNA得到了较大的发展. 与传统的定性检查不同, 其能直接反应病毒复制的程度, 指导临床治疗.

同行评议者

林潮双, 副教授, 中山大学附属第三医院感染科

研发前沿

目前, 临床上用于检测血清HBV DNA的方法较多, 随着研究的进一步深入以及检验技术的迅速发展, 新的HBV DNA检查手段不断出现.

相关报道

Zaaijer等曾经使用斑点杂交法、分支链DNA信号扩增、Abbott液相杂交、PCR、Amp-lisensor定量等对HBV患者进行血清HBV DNA灵敏度的检测. 结果发现, 各组灵敏度分别为2.5×107、2.5×106、2.5×107、2.5×102、50 copy/mL.

同行评价

本文对比PCR-EB定性及Amplisensor定量法检查乙肝患者血清中HBV-DNA的阳性率及含量, 研究两种方法在临床中的应用价值, 研究选题具有一定科学和临床意义.

1.  马 俊骥, 冯 丽英, 冯 志杰, 姜 慧卿, 孙 泽明, 赵 丽梅. HBeAg阳性和阴性慢性乙型肝炎患者肝组织病理结果分析158例. 世界华人消化杂志. 2013;21:1766-1771 WCJD.  [PubMed]  [DOI]
2.  张 磊, 张 淑云. 乙型肝炎病毒的基因变异及其临床意义. 世界华人消化杂志. 2012;20:1644-1652 Available from: http://www.wjgnet.com/1009-3079/20/1644.pdf.  [PubMed]  [DOI]
3.  董 爱爱, 赵 洁, 贾 建伟, 袁 桂玉. HBsAg定量检测在慢性HBV感染患者肝脏储备功能评价中的作用. 世界华人消化杂志. 2012;20:3033-3036 Available from: http://www.wjgnet.com/1009-3079/20/3033.pdf.  [PubMed]  [DOI]
4.  王 秋平, 陈 斌, 张 琼, 雷 秀霞, 周 小棉, 匡 艳华. 临床研究3种免核酸提取PCR试剂盒检测乙型肝炎患者血清中HBV DNA的比较. 广东医学. 2011;32:2251-2253.  [PubMed]  [DOI]
5.  秦 望森, 沈 立萍, 张 爽, 尹 文娇, 王 锋. 乙肝患者HBV感染指标、病毒复制水平与基因分型的关系分析. 中华实验和临床病毒学杂志. 2012;2:328-330.  [PubMed]  [DOI]
6.  Zaaijer HL, ter Borg F, Cuypers HT, Hermus MC, Lelie PN. Comparison of methods for detection of hepatitis B virus DNA. J Clin Microbiol. 1994;32:2088-2091.  [PubMed]  [DOI]
7.  李 珉珉, 洪 丹妮, 朱 勤爱, 朱 穗兰. PreS1抗原与HBeAg联合检测用于预测HBV-DNA的水平. 暨南大学学报(自然科学与医学版). 2011;32:637-640.  [PubMed]  [DOI]
8.  黄 清蘅, 陈 文思. 乙型肝炎病毒DNA载量与HBeAg及ALT联合检测的意义. 实用医学杂志. 2011;27:4308-4310.  [PubMed]  [DOI]
9.  裴 彦祯, 韩 涛, 马 晓艳, 李 莹, 邢 晶, 宋 佐莉. HBsAg及HBV DNA定量水平在慢性乙型肝炎、肝硬化和肝癌患者中的变化. 中华肝脏病杂志. 2011;19:743-746.  [PubMed]  [DOI]
10.  王 美容, 邱 宁, 卢 实春, 修 典荣, 于 建国, 李 彤, 刘 学恩, 庄 辉. 肝组织中HBV cccDNA荧光定量聚合酶链反应检测法的建立. 中华流行病学杂志. 2011;32:504-509.  [PubMed]  [DOI]
11.  蒋 素贞, 鲁 凤民, 庄 辉. 慢性乙型肝炎病毒DNA定量检测的临床意义. 中华检验医学杂志. 2012;35:117-121.  [PubMed]  [DOI]
12.  黄 玉梅. 酶联免疫法检测乙肝二对半与PCR法检测HBV DNA的关系. 中国实验诊断学. 2011;15:1090.  [PubMed]  [DOI]
13.  朱 锦宏, 吴 晓蔓. 乙肝患者血清HBV cccDNA的临床意义. 实用医学杂志. 2013;29:395-397.  [PubMed]  [DOI]
14.  刘 伟平, 殷 明刚, 阮 艳秋. HBV DNA检测在血清HBsAg与HBsAb共存模式中的临床价值. 医学研究杂志. 2012;41:136-139.  [PubMed]  [DOI]
15.  胡 惠萍, 袁 晓华, 詹 传华. 乙肝患者血清标志物模式与HBV DNA检测结果分析. 国际检验医学杂志. 2012;33:2269-2270.  [PubMed]  [DOI]