肠上皮细胞来源的整合素αVβ6对肠道树突状细胞TGF-β1表达的影响

摘要

目的: 肠上皮细胞(intestinal epithelial cells, IEC)来源的整合素αVβ6在肠道耐受性树突状细胞(tolerance dendritic cell, TolDC)生成中的机制研究.

方法: Balb/c ♂ 小鼠30只, 随机分为3组: 空白对照组、卵清蛋白(ovalbumin, OVA)组、OVA+抗αVβ6抗体组. 取空肠分离固有层单核细胞(lamia propria mononuclear cells, LPMC)流式细胞仪测定CD11c⁺与转化生长因子β1⁺(transforming growth factor-β1⁺, TGF-β1⁺)的比率变化. 免疫荧光双染(immunofluorescence double staining, IF)检测空肠CD11c⁺与TGF-β1⁺分布情况. Western bolt法测定TGF-β1蛋白水平变化.

结果: 流式细胞仪测定结果显示: 与空白对照组相比, OVA组肠道LPMC中的TGF-β1⁺明显增加(P<0.05), 而OVA+抗αVβ6抗体组TGF-β1⁺明显降低(P<0.05). 与OVA组相比, OVA+抗αVβ6抗体组TGF-β1⁺明显降低(P<0.05). 免疫荧光双染法显示: OVA组中TolDC细胞计数为(13.0±1.76), 较空白对照组(4.9±1.66)显著增加(P<0.01), 该组中CD11c⁺ DC细胞计数(5.0±1.83), 较空白对照组(8.1±1.91)显著减少(P<0.01); OVA+抗αVβ6抗体组中TolDC细胞计数为(3.2±1.37), 较空白对照组(4.9±1.66)无明显变化(P>0.01), 该组中CD11c⁺ DC细胞计数(11.0±2.16), 较空白对照组(8.1±1.91)无明显变化(P>0.01). Western bolt结果显示: 与空白对照组相比(0.129±0.069), OVA组(0.236±0.049)TGF-β1表达显著增高, 差异有统计学意义(P<0.05); OVA+抗αVβ6抗体组(0.174±0.075)表达也降低, 差异有统计学意义(P<0.05). 与OVA组相比, OVA+抗αVβ6抗体组(0.174±0.075)TGF-β1表达显著降低, 差异有统计学意义(P<0.05).

结论: 肠上皮来源整合素αVβ6能够增加树突状细胞(dendritic cell, DC)中TGF-β1的表达, 并使其转变为TolDC, 从而在肠道免疫耐受中起重要作用.

关键词: CD11c; 转化生长因子β; 树突状细胞; 整合素αVβ6

核心提示: 肠上皮来源整合素αVβ6能够增加树突状细胞(dendritic cell)中转化生长因子-β1的表达, 并使其转变为耐受性树突状细胞(tolerance dendritic cell), 从而在肠道免疫耐受中起重要作用.

Influence of intestinal epithelial integrin αVβ6 on TGF-β1 expression in intestinal dendritic cells

Kai Li, Peng-Yuan Zheng, Zhi-Qiang Liu, Dong-Hui Chen

Kai Li, Peng-Yuan Zheng, Zhi-Qiang Liu, Dong-Hui Chen, Department of Gastroenterology, the Second Affiliated Hospital of Zhengzhou University; Institute of Medical Microecology, Zhengzhou University, Zhengzhou 450014, Henan Province, China

Supported by: National Natural Science Foundation of China, No. 31070799.

Correspondence to: Peng-Yuan Zheng, Professor, Chief Physician, Department of Gastroenterology, the Second Affiliated Hospital of Zhengzhou University; Institute of Medical Microecology, Zhengzhou University, 2 Jingba Road, Zhengzhou 450014, Henan Province, China. medp7l23@126.com

Received: April 3, 2013
Revised: April 24, 2013
Accepted: May 12, 2013
Published online: June 18, 2013

Abstract

AIM: To determine the role of intestinal epithelial integrin αVβ6 in the generation of intestinal tolerogenic dendritic cell (TolDC).

METHODS: Thirty Balb/c male mice were randomly divided into three groups: a blank control group, an ovalbumin (OVA) group, and an OVA + αVβ6 antibody group. Lamina propria mononuclear cells (LPMCs) of the jejunum and CD11c+ and TGF-β1⁺ DCs were isolated by flow cytometry. Distribution of CD11c⁺ DCs and TolDC (CD11c⁺ TGF-β1⁺) in the jejunum was detected by double immunofluorescence. Transforming growth factor-β1 (TGF-β1) protein level was determined by Western bolt.

RESULTS: Compared to the blank control group, the number of TGF-β1⁺ DCs in LPMC in the intestine mucosa significantly increased in the OVA group (P < 0.05); however, the number of intestinal TGF-β1⁺ DCs significantly decreased in the OVA + αVβ6 antibody group compared to the OVA group (P < 0.05). TolDC cell count in the OVA group was significantly higher than that in the blank control group (13.0 ± 1.76 vs 4.9 ± 1.66, P < 0.05), while CD11c⁺ DC cell count was significantly lower in the OVA group than in the blank control group (5.0 ± 1.83 vs 8.1 ± 1.91, P < 0.05). TolDC and CD11c⁺ DC cell counts showed no significant differences between the OVA + anti αVβ6 antibody group and the blank control group (3.2 ± 1.37 vs 4.9 ± 1.66, P > 0.05; 11.0 ± 2.16 vs 8.1 ± 1.91, P > 0.05). Compared to the blank control group, TGF-β1 expression was significantly increased in the OVA group (0.129 ± 0.069 vs 0.236 ± 0.049, P < 0.05); however, TGF-β1 expression was significantly lower in the OVA + αVβ6 antibody group than in the OVA group (0.174 ± 0.075 vs 0.236 ± 0.049, P < 0.05).

CONCLUSION: Intestinal epithelial integrin αVβ6 is necessary to increase TGF-β1 expression in DCs and turn DCs into TolDC, thus playing an important role in intestinal immune tolerance.

Key Words: CD11c; Transforming growth factor-β1; Dendritic cells; Integrin αVβ6

0 引言

近年来, 食物过敏(food allergy, FA)的发病率逐年增高, 已经成为了严重影响人类健康的全球性问题, 有研究显示, 儿童发病率约4%-8%, 成人为3%-4%[1]. 目前还没有有效的治疗措施能够避免FA的发生[2], 虽然有关FA领域的研究进展迅速, 然而其发病机制仍不清楚.

研究显示, FA是以肠道口服耐受受损和Th2极化为特征的免疫反应, 主要分为IgE介导的和非IgE介导的反应[3]. 口服耐受是通过口服抗原后诱导机体对该抗原的免疫低反应性, 其可能的机制涉及到克隆清除、克隆无能或诱导调节性T细胞(T regulatory cell, Treg)产生及其调节作用. 针对食物抗原的口服耐受机制失常在将导致肠道发生Th2型过敏反应. 研究显示, 耐受性树突状细胞(tolerance dendritic cell, TolDC)在Treg产生和口服耐受中起关键作用, 能够启动机体免疫反应及维持免疫耐受性[4-6], 其高表达白介素-10(interleukin-10, IL-10)、转化生长因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β), 低表达MHCⅡ类和共刺激分子, 通过诱导Foxp3⁺ Treg来抑制免疫反应. 然而, 目前为止, 有关肠道TolDC的产生机制仍不清楚. 研究显示, 正常肠上皮细胞(intestinal epithelial cells, IEC)促进肠道TolDC和Treg细胞的分化[7-9], 并能够增加树突状细胞(dendritic cell, DC)细胞表达TGF-β. TGF-β有3个亚型TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3, 3者之间具有较高的同源性, 且功能相近, 对细胞的生长、分化和免疫功能都有重要的调节作用. 研究显示, TGF-β在TolDC的分化产生中起重要作用[10], 然而TGF-β是如何使DC转变为TolDC的机制有待进一步研究. 整合素是由24个结构不同的二聚体构成, 含α和β亚基的细胞受体, 主要是介导细胞-细胞和细胞-细胞外基质间相互作用[11]. αVβ6可结合在非活化(latent form)TGF-β的羧基末端的氨基酸序列上[12,13], 从而使TGF-β与其受体结合, 并进一步形成活化TGF-β. 卵清蛋白(ovalbumin, OVA)因具有可靠抗原性而用于食物耐受模型的建立及FA小鼠模型的研究, 我们既往研究中, 通过给予小鼠OVA和佐剂建立了经典的小鼠肠道OVA过敏模型[14]. 另有研究显示, 通过灌胃只给予OVA则能够诱导建立小鼠肠道食物抗原耐受模型[15], 其机制有待进一步研究. 我们既往通过体外细胞培养实验研究显示, 肠道上皮细胞来源外泌体中含有整合素αVβ6及食物抗原, 能够增加骨髓来源DC中TGF-β的表达, 并使之转变为TolDC[16], 但整合素αVβ6在肠道TolDC产生中是否具有重要作用仍有待进一步研究.

本研究中, 我们将通过体内试验, 首先建立小鼠OVA耐受模型, 并进一步通过抗整合素αVβ6干预, 评价肠道黏膜TolDC的产生. 抗αVβ6抗体能够阻断OVA耐受小鼠肠道中TolDC的产生. 肠上皮来源整合素αVβ6能够增加DC中TGF-β1的表达, 并使其转变为TolDC, 从而在肠道免疫耐受中起重要作用, 本研究为FA性疾病发病机制的研究提供了新的理论依据.

1 材料和方法

1.1 材料

卵清蛋白、抗小鼠αVβ6、DNaseⅠ酶(美国Sigma公司) , collagenase Ⅳ酶(Roche公司)和dispase Ⅱ酶(Roche公司), FITC-抗CD11c(BioLegend公司), PE-抗小鼠TGF-β1(美国ebioscience公司), 蛋白提取试剂(北京鼎国), TGF-β1(Santa cruz), Hrp标记二抗(北京中山生物技术有限公司). Balb/c小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司[合格证号SCXK(京)2007-0001], 在清洁无抗原及微生物环境下饲养, 实验经郑州大学动物伦理委员会批准.

1.2 方法

1.2.1 动物模型的建立: ♂ Balb/c小鼠30只, 6-8周龄, 随机分为3组, 每组10只: 空白对照组(A组)、OVA组(B组)、OVA+抗αVβ6抗体组(C组). B组每只小鼠给予1 mg OVA(溶于0.3 mL生理盐水), 于第0、1、2、3天灌胃, 第7、9、13天再次给予1 mg OVA灌胃进行激发. A组只给予等体积的生理盐水(NS)进行灌胃及激发, 作为空白对照. C组小鼠在第7、9、13天每次给予1 mg OVA灌胃进行激发前30 min腹腔注射抗αVβ6抗体(10 μg溶于0.3 mL NS).

1.2.2 肠道固有层单个核细胞的分离: 无菌取小鼠空肠组织, PBS冲洗3次, 剪成长约1 cm的组织片段, 经PBS再次冲洗, 置于含有5 mmol/L EDTA和1 mmol/L DTT的PBS中室温振荡孵育20 min. 100 μm滤网过滤, 然后将组织置消化溶液(0.05%Ⅳ胶原酶, 0.05%DNaseⅠ和0.03%中性胶原酶)消化20 min. 40 μm滤网过滤, 重复冲洗2次. 40/80 Percoll梯度离心, 分离的LPMC培养过夜[17].

1.2.3 免疫磁珠法进行细胞分选及流式细胞仪检测: 各组小鼠肠道固有层单个核细胞分离后, 经密度梯度离心去除死细胞, 过滤成单细胞悬液, 300 g×10 min离心收集细胞, 加入经抗CD11c抗体包被的免疫磁珠10 μL, 混匀, 冰上孵育15 min, 离心重悬细胞. 把MS型细胞分选柱放入MACS分选架, 加入500 μL缓冲液冲洗分选柱, 然后加入细胞悬液, 收集流出细胞悬液, 待液体流干后, 加入500 μL缓冲液冲洗共3次, 收集的细胞为免疫磁珠非结合细胞部分. 把分选柱转移出磁场, 加入500 μL缓冲液后, 迅速把与免疫磁珠结合的细胞推出, 收集后的细胞为CD11c阳性DC细胞. PBS液重悬细胞, 调整细胞浓度至1×10⁶/mL. 将PE标记的抗小鼠CD11c 0.2 μL、FITC标记的抗小鼠TGF-β 0.2 μL加入细胞悬液, 冰上染色30 min, PBS洗涤2次, PBS重悬细胞后过滤网, 流式细胞仪检测.

1.2.4 免疫荧光步骤: 迅速取各组小鼠空肠组织放入福尔马林固定液固定4 h. 制备组织石蜡切片, 切片脱蜡至水, PBS洗3次, 柠檬酸抗原修复10 min, 自然冷却, PBS浸泡, 3%H₂O₂封闭内源性过氧化物酶, 室温20 min, PBS浸泡, 滴加山羊血清50 μL/片,室温封闭内源性生物20 min, 甩除勿洗, 滴加一抗(CD11c, TGF-β1)100 μL/片, 4 ℃过夜, PBS浸泡, 滴加TRITC标记二抗(羊抗兔), 37 ℃孵育2 h, PBS浸泡, DAPI复染胞核, PBS浸泡, 荧光显微镜下采集图像.

1.2.5 Western blot检测细胞中TGF-β1蛋白表达: 按蛋白提取试剂盒提取各组分离的肠道LPMC中CD11c阳性细胞的总蛋白, Bradford法对蛋白样品进行定量. 取出30 μg蛋白经过煮沸变性后进行SDS-PAGE凝胶电泳并转至硝酸纤维膜上, 脱脂牛奶于4 ℃封闭过夜后, 分别用TGF-β1抗体4 ℃孵育过夜, 然后加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG抗体(1:10000)室温2 h, 最后加ECL发光剂于暗室充分反应后用胶片曝光, 蛋白含量用每组样本所测得的TGF-β1蛋白灰度值与对应的β-actin蛋白的灰度值的比值表示.

统计学处理 实验数据均以mean±SD表示, 采用SPSS17.0统计软件包进行分析, 单因素方差分析比较各组间有无统计学差异, 采用α = 0.05为假设检验标准.

2 结果

2.1 αVβ6抗体阻断能够减少肠道DC中TGF-β1的表达

分离各组小鼠肠道LPMC, 免疫磁珠分选肠道DC细胞, 流式细胞仪分析, 结果显示, OVA组肠道中CD11c⁺TGF-β1⁺表达量为(18.400±0.835), 较空白对照组(3.190±0.069)明显增加(P<0.05), 而OVA+抗αVβ6抗体组CD11c⁺ TGF-β1⁺表达量为(1.620±0.109), 较空白照组(3.190±0.069)明显降低(P<0.05). OVA+抗αVβ6抗体组中CD11c⁺ TGF-β1⁺表达量为(1.620±0.109), 较OVA组(18.400±0.835)明显降低(P<0.05). 提示αVβ6抗体阻断能够减少肠道DC中TGF-β1的表达(图1).

图1 小鼠肠道黏膜DC细胞中TGF-β1表达. A: 各组肠道黏膜LPMC来源CD11c阳性细胞用于进一步分析; B: 各组CD11c阳性细胞中TGF-β1表达阳性细胞比率; C: 各组小鼠肠道LPMC来源细胞中CD11c、TGF-β1双阳性细胞的百分率( n = 10). ^aP<0.05 vs αVβ6组. LPMC: 空肠分离固有层单核细胞; TGF-β1: 转化生长因子β1; OVA: 卵清蛋白.

2.2 αVβ6抗体阻断导致肠道TolDC细胞数量较少

颈椎脱臼法处死小鼠, 立即取小鼠空肠组织, 福尔马林固定制作组织切片, 经抗经CD11c和抗TGF-β1抗体染色, 荧光纤维镜观察染色阳性细胞. 观察到CD11c⁺ DC细胞被染成绿色, TolDC细胞被染成棕黄色, 每只小鼠肠道黏膜组织随机取20个视野在高倍镜下观察计数阳性细胞数目并求平均值(图2).

图2 肠道细胞数量变化. A: CD11c+细胞数目变化情况( n = 10); B: TolDC细胞数目变化情况( n = 10); C-E: 肠道TolDC细胞数量变化(×400); C: 对照组; D: OVA组; E: OVA+αvβ6组. 白色箭头表示CD11c+ DC细胞, 黄色箭头表示TolDC细胞(CD11c+ TGF-β1+). ^aP<0. 05 vs αVβ6组. OVA: 卵清蛋白; TolDC: 耐受性树突状细胞; TGF-β1: 转化生长因子β1.

空白对照组(图2C)TolDC细胞数为(4.9±1.66), CD11c⁺ DC细胞数(8.1±1.91). 与空白对照组相比OVA组(图2D)TolDC细胞(13.0±1.76)数明显增多(P<0.01), 而CD11c+ DC细胞(5.0±1.83)明显减少(P<0.01); 与空白对照组相比, OVA+抗αVβ6抗体组(图2E)TolDC细胞(3.2±1.37)无明显变化(P>0.01), CD11c⁺ DC细胞(11.0±2.16)无明显变化(P>0.01). 提示OVA可促进CD11c⁺ DC细胞向TolDC细胞转化, 但是该转化可被抗αVβ6抗体阻断(表1).

表1 3组中TolDC细胞和CD11c⁺ DC细胞数目 (mean±SD).

	空白对照组	OVA组	OVA+抗αVβ6抗体组	F值
CD11c+TGF-β1+	4.9±1.66	13.0±1.76b	3.2±1.73d	108.092
CD11c+DC细胞	8.1±1.91	5.0±1.82b	11.0±2.16d	23.273

^bP<0.01,

^dP>0.01 vs 空白对照组. OVA: 卵清蛋白; TolDC: 耐受性树突状细胞; TGF-β1: 转化生长因子β1.

2.3 抗αVβ6抗体干预后, 肠道DC细胞中TGF-β1蛋白表达量明显下降

取分离的各组小鼠肠道LPMC, 免疫磁珠分离CD11c阳性细胞并提取总蛋白, Western blot分析TGF-β1蛋白表达量. 经OVA激发后, 该组肠道DC细胞中TGF-β1蛋白表达量(0.236±0.049), 较空白对照组(0.129±0.069)明显增加(P<0.05), 而OVA+抗αVβ6抗体组中TGF-β1蛋白表达量(0.174±0.075), 较OVA组(0.236±0.049)明显减少(P<0.05)(图3).

图3 各组小鼠肠道DC细胞中TGF-β1的表达量. 1: 对照组; 2: OVA组; 3: OVA+αvβ6组. ^aP<0.05 vs αvβ6组. OVA: 卵清蛋白; DC: 树突状细胞; TGF-β1: 转化生长因子β1.

3 讨论

在过去的几十年里, 过敏性疾病的发病率显著增加, 已经形成比较严重的健康问题. 人们普遍认为, 肠溶微生物参与胃肠道中的多种生理功能的调节, 包括竞争与减少病原体定植, 促进不易消化物质的降解, 促进短链脂肪酸、叶酸和维生素的产生, 刺激肠上皮细胞的代谢以及黏膜免疫的形成[18-20]. 许多免疫活性细胞参与过敏性疾病的发生发展: Th2细胞极化、DC激活、Treg、效应性CD4⁺和CD8细胞等. Treg活性丧失很可能在打破口服耐受和进而发生的FA中起重要作用, 而TolDC在Treg产生和口服耐受中起关键作用[21]. 与身体其他器官相比, 肠道固有层拥有更多的TolDC, IEC在该细胞产生过程中具有重要作用, 而TolDC能够使肠道针对食物抗原保持免疫耐受状态.

TGF-β作为二聚体多肽生长因子家族的成员, 参与细胞功能调节、增殖、分化和迁移. 在TGF-β已知的3个异构体(TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3)中, TGF-β1主要在免疫系统中表达, TGF-β1主要与其受体结合来调节免疫功能, 以非活化的状态存在, 被激活后才能发挥其潜在的复杂的生物学作用. 正常IEC能够促使非活化TGF-β1高表达在DC的表面. 当小鼠摄入蛋白质抗原时, 整合素αVβ6在IEC中表达量上升. 在本实验中通过OVA灌胃, 诱导小鼠产生口服免疫耐受, 分离小肠空肠LPMC, 经免疫磁珠进一步纯化DC, 流式细胞仪分析DC中TGF-β1的表达显示: OVA组中TGF-β1的表达量显著上升, 而经过抗αVβ6抗体的拮抗后TGF-β1表达量显著下降.

体外培养IEC, 经食物抗原刺激后, IEC中αVβ6的表达量增加; 体外得到的外泌体经食物抗原刺激后, 能够携带αVβ6和抗原, 并可被DC捕获. 本研究发现小鼠经OVA刺激后, 空肠组织免疫荧光发现TolDC的表达数量增加, 而使用αVβ6抗体拮抗后, 其数量明显降低, 没有接受抗原刺激的空白组则没有变化, 说明食物抗原诱导免疫耐受的产生. 另外小鼠经OVA刺激后, TGF-β1蛋白表达增加; 经抗αVβ6抗体干预后, TGF-β1表达下降, 提示αVβ6能够促进TGF-β1活化. 最近研究表明DC的CD103的上调需要上皮衍生转化生长因子TGF-β和视黄酸, 上皮细胞来源的DC反过来可以诱导分化适应肠道环境Foxp3+ Treg细胞[22,23]. 另有研究表明肠上皮细胞来源外泌体中有整合素αVβ6的表达, 在肠道中食物抗原的协同作用下, 能够诱导肠道黏膜中分泌TGF-β1的TolDC产生, 进而促使Treg细胞产生TGF-β1[24].

肠道是表面积最大的免疫器官, 而IEC处于机体与外界抗原接触的第一线, 表面表达一系列表面分子, 通过限制肠腔细菌和食物过敏原的穿透, 在维护肠道内环境稳定中起着至关重要的作用. 我们实验结果提示IEC来源的αVβ6在肠道TolDC产生中可能具有关键作用. 整合素αVβ6的功能之一就是从TGF-β1分子上游离隐性相关肽, 使活化的TGF-β1增加, 活化的TGF-β1可以促使TolDC细胞的分化. 分化的TolDC可抑制过敏性免疫反应, 并改善其相应的过敏症状.

评论

背景资料

近年来, 食物过敏(food allergy, FA)的发病率逐年增高. 研究显示, FA是以肠道口服耐受受损和Th2极化为特征的免疫反应. 耐受性树突状细胞(tolerance dendritic cell, TolDC)在调节性T细胞的产生和口服耐受中起关键作用, 而转化生长因子β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)在维持树突状细胞(dendritic cell, DC)耐受表型中起重要作用. 整合素αVβ6可促使TGF-β活化.

同行评议者

马欣, 主任医师, 甘肃省人民医院消化科

研发前沿

整合素αVβ6是整合素αV亚家族的一种, 其可结合在羧基末端的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列上, 从而使TGF-β更易于与其受体结合并进一步形成活化TGF-β. 肠道上皮细胞来源外泌体中含有整合素αVβ6及食物抗原, 能够增加骨髓来源DC中TGF-β的表达, 并使之转变为TolDC, 但整合素αVβ6在肠道TolDC产生是否具有重要作用仍有待进一步研究.

相关报道

卵巢癌中TGF-β1水平增加, 而整合素αVβ6在TGF-β1的活化中起着作用, 如果整合素αVβ6被抗体所阻断, 那么TGF-β1将不能激活癌细胞. 也有研究显示肠上皮细胞来源外泌体中有整合素αVβ6的表达, 在肠道中食物抗原的协同作用下, 能够诱导肠道黏膜中分泌TGF-β1的TolDC产生.

创新盘点

本研究通过动物实验, 探讨肠上皮细胞来源的整合素αVβ6在肠道中TolDC产生中的作用.

应用要点

整合素αVβ6的功能之一就是从TGF-β1分子上游离隐性相关肽, 使活化的TGF-β1增加, 活化的TGF-β1可以促使TolDC细胞的分化, 分化的TolDC可抑制过敏性免疫反应, 诱导机体免疫耐受恢复, 并改善过敏症状. 因此, 通过增强αVβ6分子靶点而改善TolDC分化的治疗FA是一个很好方向.

同行评价

本文条理分明, 有系统的理论分析和有价值的科学结论, 较好的反映了我国基础研究的先进水平.

备注

编辑:田滢 电编:鲁亚静

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