骨桥蛋白与肝癌转移复发关系的研究进展

摘要

骨桥蛋白(osteopontin, OPN)是一种分泌性磷酸化糖蛋白, 首先发现于人体正常组织中, 是重要的黏附因子之一. 随着研究的深入, 在许多肿瘤侵袭、进展及转移过程中亦可见OPN表达升高. OPN在肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)的转移复发过程中占有重要地位, 是一种肿瘤标志物, 也可能成为一种新的抗癌治疗靶点. 本文对OPN的分子、生理特性, OPN在HCC转移复发中的相关机制, 诊断预测及治疗进行综述.

关键词: 骨桥蛋白; 肝癌; 转移; 复发

核心提示: 骨桥蛋白(osteopontin, OPN)在肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)的转移复发中占有重要地位. 本文对OPN的分子、生理特性, 及OPN在HCC转移复发中的相关机制, 诊断预测及治疗进行综述.

Advances in understanding relationship between osteopontin and metastasis and recurrence of hepatocellular carcinoma

Jing-Yun Sun, Ji-Min Xu, Ming Yan, Fang Ye

Jing-Yun Sun, Ji-Min Xu, Ming Yan, Fang Ye, the First Clinical Medical College, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210000, Jiangsu Province, China

Supported by: the Project Funded by the Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions, No. YS2012ZYX109; the Basic Research Program of Department of Science and Technology of Jiangsu Province, No. BK2010563.

Correspondence to: Fang Ye, Professor, the First Clinical Medical College, Nanjing University of Chinese Medicine, 282 Hanzhong Road, Nanjing 210000, Jiangsu Province, China. yefang973@163.com

Received: January 25, 2013
Revised: April 20, 2013
Accepted: May 12, 2013
Published online: June 8, 2013

Abstract

Osteopontin (OPN), first found in normal human tissue, is a secreted phosphorylated glycoprotein and one of the most important adhesion factors. Increased expression of OPN has been found in many types of tumors. OPN plays a very important role in the metastasis and recurrence of hepatocellular carcinoma (HCC). As a tumor marker, OPN may also become a new therapeutic target for cancer. This review aims to elucidate the structure and function of OPN, its role in HCC recurrence and metastasis, and the significance of OPN in HCC diagnosis and treatment.

Key Words: Osteopontin; Hepatocellular carcinoma; Metastasis; Recurrence

0 引言

肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是癌症致死的第3大病因[1]. 现有手术、经动脉化疗栓塞、射频等用于临床HCC治疗, 但是由于高复发率和肝内转移, HCC的预后依然较差. 因此, 近年来, 人们更多的关注HCC转移复发的早期检测问题. 已知一些癌基因、生长因子等与HCC转移复发密切相关, 寻找到一种或几种高特异性和敏感性的HCC转移复发的标志物成为当前研究的重点. Senger等[2]首先报道了骨桥蛋白(osteopontin, OPN)在恶性转化的细胞株中表达增高. 此后发现OPN在许多肿瘤中过表达, 参与肿瘤的转移和复发[3], 近来有关OPN与HCC转移复发相关研究也日益增多, 现将有关进展综述如下.

1 OPN分子特点和生理特点

OPN通常由骨、牙齿、肾脏及上皮细胞、激活的免疫细胞表达和分泌. 他首先发现于骨骼中, 是SLBLING(small integrin-binding ligand N-linked glycoprotein)家族中的一员. OPN基因定位在染色体4q13, 是单一编码基因, 8 kb大小, 由7个外显子和6个内含子组成, 其相对分子质量约为44 kDa, 约含300个氨基酸残基, 包含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp, RGD)序列、凝血酶裂解位点、基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMP)作用位点、非RGD细胞黏附位点和钙离子结合位点.

OPN的生理功能主要有: (1)介导细胞黏附. OPN通过细胞黏附序列RGD和非依赖RGD序列与细胞表面的多种整合素受体(αv3、αvβ5、CD44v6)结合, 通过某些机制与细胞外基质(extracellular matrix, ECM)结合, 参与细胞的黏附、迁移和增殖; (2)调节矿化组织的形成与重建; (3)免疫应答. OPN曾被称为早期T淋巴细胞活性蛋白, 在细胞免疫应答过程中, OPN是重要的也是最早期起作用的细胞因子, 可增强Th1的表达并抑制Th2的表达; (4)抑制细胞凋亡. OPN与细胞表面αβ3整合素结合, 活化核因子κB(nuclear factor-κB, NF-κB), 从而抑制细胞凋亡; (5)诱使新血管生成. OPN参与机体心血管、消化、免疫等系统代谢, 且在炎症反应和组织修复过程中起重要作用.

2 OPN与HCC转移复发的密切相关性

OPN除了参与人体正常的生理活动外, 亦参与炎症、肿瘤等病理过程[4,5]. 目前许多基础和临床研究证明OPN与肿瘤的发生、转移复发关系密切, 包括甲状腺癌[6]、胃癌[7]、前列腺癌[8]、肺癌[9]等. Coppola等[10]指出与正常组织比较, OPN在肿瘤组织中的表达明显增强, 在肿瘤转移[11,12]患者的血浆中, 亦检测到血浆OPN水平升高.

Pan等[13]使用差异显示法分析发现在HCC患者中OPN mRNA优先增高, RNA印迹法证实了这一结果; 使用RT-PCR分析240例单病灶HCC手术切除患者, 结果示OPN mRNA在133例患者中过表达, 且OPN的过表达与AFP升高、p53突变、肿瘤体积大、分期晚、分级高、早期复发转移以及10年低生存率有关. 此外, Xie等[14]随访72例乙型肝炎相关的HCC患者, 发现OPN过表达与包膜浸润、门静脉侵袭、淋巴结转移及预后差相关. 而Wu等[15]发现HCC组织中OPN表达水平与Edmondson分级、血管或胆管侵袭、肝内转移相关, 与乙型肝炎表面抗原、血清甲胎蛋白(α-fetoprotein, AFP)、肝纤维化、肿瘤大小和结节数目、包膜浸润、肝外侵袭、TNM分级无明显相关性. Ye等[16]发现伴随转移的原发性HCC与相应的转移癌的基因表达特点相似, 指出在有转移潜能的原发性癌时期就启动了与转移进程相关的分子程序; OPN作为首要基因, 在转移性HCC中过表达, 体外OPN特异性抗体有效的抑制了HCC细胞的侵袭及在裸鼠体内的肺转移, 建议OPN可作为转移性HCC的诊断标志物及治疗靶点.

3 OPN参与HCC转移复发机制研究

3.1 OPN不同亚型及片段

OPN的不同亚型是造成其功能多样化的原因之一, Phillips等[17]研究发现体外OPN 3种亚型(OPN-a、OPN-b、OPN-c)都能以旁分泌的形式促进HCC细胞增殖. 有研究[18]显示在体外培养中, OPN-c较OPN-a更能促进乳腺癌非贴壁依赖细胞的增殖. Takafuji等[19]发现体外MMP-9切割OPN-c, 产生OPN-5 kDa, OPN-5 kDa通过与CD44受体结合从而诱使HCC细胞侵袭. Chae等[20]研究OPN的不同的亚型对有转移能力的HCC细胞系的影响, 发现有转移潜能的HCC细胞趋向于表达OPN-a和OPN-b, 而正常肝脏组织主要表达OPN-c, 指出OPN-a和OPN-b可通过增加尿激酶型纤溶酶原激活物表达和p42/p44 MAP激酶的磷酸化作用从而促进HCC细胞的转移活动, 但是OPN-c不能激活这些信号通路.

3.2 OPN与HCC细胞凋亡

细胞增殖, 细胞周期延长, 细胞凋亡抑制是肿瘤进展的重要环节[21]. 体外研究[22]发现OPN缺乏的小鼠血管平滑肌细胞, 其整合素α1β1介导的血管平滑肌细胞与胶原黏附能力下降, 且细胞凋亡增高. 在细胞的缺氧/再氧化过程中, Kim等[23]发现OPN经Caspase8蛋白水解作用所产生的片段通过P53蛋白调节细胞凋亡. Zhao等[24]使用SiRNA沉默HCC细胞OPN后, 发现αv、β1和β3整合素表达及NF-κB激活受抑制, Bcl-2/Bcl-xL及XIAP表达水平下调, Bax蛋白表达上调, 最终诱导线粒体介导的细胞凋亡进程. 使OPN表达下调能够抑制药物引导的NF-κB激活, 且能够增加体外HCC细胞对化疗药物的敏感性及促进人HCC裸鼠异体移植瘤的完全消退.

3.3 OPN与HCC血管生成及血管拟态

肿瘤的持续生长及转移与血管的形成密切相关. 研究[25]发现在内皮细胞内, OPN可通过激活血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)参与的PI3K/AKT和ERK1/2通路, 直接诱导肿瘤血管生成. 在HCC转移的小鼠模型内, VEGF/OPN-BsAb双抗体较VEGF-A单抗体能够明显抑制肿瘤血管生成[26]. 与经典肿瘤血管生成途径不同, 血管拟态(vasculogenic mimicry, VM)是不依赖机体内皮细胞的全新肿瘤微循环模式, Liu等[27]比较两种HCC细胞系, 相较于无转移潜能的Hep3B细胞系, 有转移潜能的MHCC97-H细胞系VM生成, OPN表达增高, 在HCC组织中VM形成与OPN、基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinases-2, MMP-2)及uPA呈明显正相关.

3.4 OPN与HCC细胞表面受体结合, 参与HCC转移复发过程

Gao等[28]使用永生化肝细胞HepG2检测OPN与CD44两种亚型CD44标准型和CD44v6结合情况, 发现OPN可能是通过与αv3整合素结合, 增加质膜CD44v6的表达及与透明质酸盐(hyaluronicacid, HA)的黏附, 从而达到促使HCC细胞转移. 张岚等[29]通过HCC组织芯片检测OPN下游的信号蛋白, 发现OPN及其受体整合素αv、CD44v6和相关信号分子p-FAK、p-Src、Src、p-ERK、p-AKT在HCC组织中的表达水平均高于癌旁正常肝组织, 指出OPN通过其受体整合素αV、CD44v6激活下游的丝裂原活化蛋白激酶途径以促使HCC转移.

恶性肿瘤细胞的侵袭和转移是一个动态过程. 首先肿瘤细胞从原发灶脱落, 侵入到ECM, 与基底膜和细胞外间质中的一些分子黏附, 参与合成、分泌一些降解酶, 在这些酶的协助下, 肿瘤细胞完成逃逸过程. 在恶性肿瘤转移和复发过程中, MMPs的分泌水平及活性增高, 参与细胞外基质的降解[30-32]. Chen等[33]通过持续转染使较弱致瘤性, 非转移性人类HCC细胞系SMMC-7721细胞OPN过表达, 发现其转移和侵袭能力较空染组细胞增强, MMP-2和uPA明显上调; 且使用CD44v6抗体能够明显抑制OPN过表达的SMMC-7721细胞的侵袭活动, 指出OPN通过与受体CD44v6的结合及上调MMP-2和uPA的表达, 可能是其促进HCC细胞的侵袭的机制之一.

Sun等[34]使用3种慢病毒介导的microRNA抑制OPN表达, 分别为Lenti.OPNi-1、Lenti.OPNi-2和Lenti.OPNi-3(下调OPN表达水平分别为62%、78%和95%), 发现Lenti.OPNi-2和Lenti.OPNi-3能够明显抑制HCC细胞的侵袭和转移, 且只有Lenti.OPNi-3能够抑制HCC细胞增殖, 并指出肿瘤生长所需的OPN水平低于其侵袭和转移所需量, OPN促进肿瘤转移除了与MAPK通路激活有关, 还与NF-κB(P65)蛋白核转位, 以及MMP-2产生/激活有关. 可见在HCC细胞转移复发过程中, OPN与整合素受体αV3和/或CD44 v6受体, 激酶(如MAPKs)的活化, 转录因子(如NF-κB)激活, 基质降解酶(如MMPs, uPA)分泌等密切相关. 此外Xue等[35]发现体外凝血酶促进了OPN阳性的HCC细胞的增殖和附着, 指出凝血酶可能是通过激活整联β1/FAK信号通路从而促进OPN阳性HCC细胞的增殖和侵袭活动.

4 OPN在HCC转移复发中诊断研究

目前AFP广泛应用于临床HCC的筛选和诊断, 但是仍有假阳性和假阴性, 约30%的HCC患者出现AFP假阴性, 特别对于肝切除术后HCC转移复发患者仍缺少预测性诊断, 从而错过最佳治疗时期.

4.1 血OPN对HCC转移复发的诊断学意义

HCC细胞产生大量OPN, 部分释放入血, 致使血浆OPN升高, 且OPN在血中相对稳定, OPN的升高与AFP并不完全一致, 研究[36,37]表明OPN监测较AFP更加灵敏. 刘兵团等[38]监测51例HCC患者的外周血OPN的表达水平并根据血清OPN表达曲线分析结果将血清OPN 76.2 μg/L作为诊断HCC的临床指标, 其诊断HCC的灵敏度、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为90.2%、90.6%、93.8%、85.3%. Zhang等[39]研究发现, 与正常对照组相比, 101例HCC患者的血浆OPN水平明显较高(OPN中位数63.74 ng/mL vs 176.90 ng/mL, 手术后复发患者的血浆OPN水平与未复发患者也有明显差异(213.55 ng/mL vs 153.70 ng/mL). Sun等[40]随诊68例HCC根除性切除术后患者, 发现手术前血浆高OPN组(≥100 ng/mL, n = 23)的肿瘤复发率明显高于血浆低OPN组(<100 ng/mL, n = 45), 建议将OPN值100 ng/mL作为预测TNMⅠHCC预后的临界点. 张辉等[41]研究指出血浆OPN表达水平和HCC复发密切相关, 可以作为术后复发转移的预测指标, 建议将术后OPN值200 μg/L作为HCC高复发风险的临界点.

4.2 OPN与其他分子联合检测HCC早期转移复发

HCC的转移复发由多种基因参与, 分子病理学的发展为发现和证实肿瘤进展中特异表达的基因提供了很多方法, Hua等[42]使用含有15843个基因探针的cDNA阵谱检测HCC组织和正常肝脏组织的不同基因表达, 其中两种基因OPN和S100A6的表达差异>10倍, 使用免疫组织化学分析发现51例HCC患者中26例患者OPN表达, 16例患者S100A6表达, 而在11例正常对照组中未发现这些基因编码的蛋白质, 且OPN和S100A6与分化程度低的HCC密切相关.

Yang等[36]指出302例HCC切除患者中, OPN和CD44预测肿瘤再发的敏感性和特异性分别为27.8%和80.6%、40.5%和83.7%, 同时采用OPN和CD44预测时其敏感性和特异性分别为54.9%和70.5%, 在血清AFP正常组中, OPN和CD44联合预测肿瘤再发的敏感性和特异性分别为68.7%和61.9%, 为血清AFP阴性的HCC患者的肿瘤复发预测提供了重要价值. 研究[43]表明将AFP、 OPN及TATI 3种基因的表达按照表达个数分成4组分别为0、1、2、3组, 在0组中门脉侵袭和肿瘤的早期复发发生率较低(分别为9%和19%)(P<1×10^-8), 而3组中门脉侵袭和ERT发生率(分别为70%和80%)(P<1×10^-8)增加了4到7倍, 3种基因异常表达的数目越多, 5年生存率越低. 此外还有使用OPN与AFP[40], Caspase3[44], GPC3[45]的研究为OPN作为临床筛查及预测HCC转移复发的指标提供了一定的依据.

5 以OPN为治疗靶点防治HCC转移复发

随着分子生物学的发展, 分子靶向药物的研究已成为国内外研究的重点, HCC诊疗指南指出分子靶向治疗在控制HCC的肿瘤增殖, 预防和延缓复发转移以及提高患者的生存质量等方面可能具有独特的优势. 动物实验研究中, 以OPN为靶点的治疗能够有效抑制OPN高表达的HCC细胞系的转移活动[46]. Chen等[47]研究发现, 体外由经修饰的反义核苷酸(A 2'-O-methoxyethylribosemodified phosphorothioate antisense oligonucleotides, ASO)下调OPN表达的HCCLM6细胞的转移和侵袭能力与作为对照的寡核苷酸组相比均明显下降, 将HCCLM6细胞移植进裸鼠体内, 使用OPN ASO明显降低了肺转移. RNA干扰(RNAi)技术亦可沉默基因[48,49], 林帆等[50]发现体外使用小干扰RNA(siRNA)沉默OPN基因表达对人HCC细胞株侵袭转移起到抑制作用. 转录因子是一种结构特殊、能够行使调控基因表达功能的蛋白质分子, OPN的表达受到众多转录调控元件和细胞因子的调控, 研究[51]发现11种转录因子在具有转移潜能的HCC细胞系HCCLM6中过表达, 另有11种转录因子表达下调, 其中一种上调转录因子c-Myb能够结合OPN启动子、增加其转录活动, 使用SiRNA沉默c-Myb则能抑制OPN表达, 同时能够明显抑制HCCLM6细胞系的迁移和侵袭活动.

OPN分子中含有凝血酶酶切位点, 而该酶切位点为进化保守序列, OPN被凝血酶裂解后的两个片段分别为整合素结合域和CD44结合域. Xue等[35]发现OPN过表达的HCC患者, 凝血酶的表达与肿瘤复发率及存活率密切相关, 体外研究发现凝血酶促进了OPN阳性的HCC细胞的增值和附着, 指出凝血酶可作为OPN阳性的HCC患者的治疗靶点. 此外Kou等[26]使用双抗体, 包括抗VEGF-A抗体bevacizumab和抗OPN抗体hu1A12(VEGF/OPN-BsAb), 能够有效抑制植入高转移性的人类HCC细胞的裸鼠模型的肿瘤血管生成, 且能够抑制原始肿瘤生长及肺转移.

6 结论

OPN与HCC转移复发的关系是值得肯定的, 但是我们亦知HCC转移复发是多因素参与的, OPN过表达并非唯一因素. 目前仍存有一些问题有待进一步探讨: (1)OPN促进HCC转移复发的机制尚未完全明确, 随着分子生物学的研究的发展, OPN介导的HCC转移复发机制将近一步完善; (2)大部分关于OPN预测HCC转移复发的研究对象局限于亚洲有慢性乙型肝炎感染、肝脏切除病史的患者, 有研究者[52]同时探讨导致肝硬化的其他病因对OPN表达的影响, 由于样本量少, 未能作出准切评估. Kim等[53]研究46例经动脉化疗栓塞的HCC患者血清OPN表达的预测价值, 发现血清OPN与肝脏疾病的潜在病因之间没有相关性, 是肿瘤本身影响血清OPN的表达. OPN与HCC的病因之间的关系如何, 需更大规模的样本数来检验; (3)关于血浆OPN与HCC转移复发的报道较少, 血浆OPN在手术等治疗前后都可以通过非侵入性手段得到, 为方便用于临床, 今后需开展更多的动物实验及临床研究, 同时OPN与其他HCC转移复发标记物的联合诊断可与AFP补充, 为HCC的转移复发的诊断提供参考; (4)目前以HCCOPN靶向的药物研究较少, 且仅限于实验室研究阶段, 开发针对或调控OPN的特异性药物是今后的研究方向.

评论

背景资料

骨桥蛋白(osteopontin, OPN)是1979年Senger等首次报道一种转化特异性分泌蛋白, 和感染、动脉硬化等相关, 近来陆续发现和许多肿瘤细胞转化、浸润和转移有关. 有研究显示在有转移潜能的原发性癌时期就启动了与转移进程相关的分子程序, 且OPN为首要基因.

同行评议者

戴朝六, 教授, 中国医科大学第二临床学院(盛京医院)肝胆外科; 单云峰, 副主任医师, 温州医学院第一附属医院肝胆外科

研发前沿

(1)机制问题: OPN促进肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)转移复发的机制尚未完全明确; (2)应用于临床筛查: 血浆OPN在手术治疗前后的任何时候都可以通过非侵入性手段得到, 同时OPN与其他基因的联合诊断可与甲胎蛋白(α-fetoprotein, AFP)补充, 为HCC的诊断, 转移和复发提供参考; (3)靶点治疗: 开发针对或调控OPN的特异性药物.

相关报道

OPN在许多肿瘤侵袭、进展及转移过程中过表达, 是一种新的肿瘤标志物, 也可能成为一种新的抗癌治疗靶点. 本文对OPN的分子、生理特性, 及OPN在HCC转移复发中的相关机制, 诊断预测及治疗进行综述.

创新盘点

本文综述OPN的分子、生理特性, 及OPN在HCC转移复发中的相关机制, 诊断预测及治疗, 特别综述了近年关于OPN作为诊断HCC转移复发的标志物及治疗靶点的研究进展.

应用要点

本文就OPN与HCC转移、复发的研究进展做了较为详细的综述, 且指出目前研究中出现的问题? 例如未能明确OPN参与HCC转移复发的具体机制, 以OPN作为诊断及治疗靶点的研究实验虽取得一定进展, 运用于临床仍需要进一步研究.

同行评价

本文就OPN与HCC转移、复发的研究进展做了较为详细的综述, 为深入研究肝癌复发转移的关系提供了一定参考.

备注

编辑: 田滢 电编: 闫晋利

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