蛋白质乙酰化与肝纤维化

摘要

蛋白质中赖氨酸ε氨基(Nε)乙酰化, 是多肽侧链上氨基的乙酰化, 由赖氨酸乙酰转移酶(acetyltransferases, KATs)催化. 该过程是可逆的, 去乙酰化是由组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases, HDACs)催化完成. Nε乙酰化(以下简称K乙酰化)是与磷酸化同等重要的蛋白质修饰, 参与各种生理病理过程. 蛋白乙酰化参与肿瘤, 尤其是造血系统肿瘤的发生已有大量研究. 近来, 美国FDA批准HDACs抑制剂romidepsin(Istodax)和vorinostat(SAHA)用于临床治疗皮肤T细胞淋巴瘤. 蛋白乙酰化与实体肿瘤和非肿瘤性疾病发生的关系必将会成为今后研究的热点, 现将蛋白乙酰化在肝纤维化发生中的作用作一概述.

关键词: 蛋白质赖氨酸乙酰化; 肝纤维化; 肝星状细胞; 组蛋白去乙酰化酶抑制剂

Role of lysine acetylation of proteins in the pathogenesis of hepatic fibrosis

Jin-Sheng Zhang

Jin-Sheng Zhang, School of Basic Medical Sciences, Fudan University, Shanghai 200032, China

Correspondence to: Jin-Sheng Zhang, Professor, Department of Pathology, School of Basic Medical Sciences, Fudan University, 138 Yixueyuan Road, Shanghai 200032, China. jszhang44@shmu.edu.cn

Received: October 29, 2012
Revised: December 9, 2012
Accepted: December 28, 2012
Published online: December 28, 2012

Abstract

Protein acetylation is a widely studied covalent modification that affects gene regulation in eukaryotic cells. The post-translational ε-amino lysine acetylation of proteins is highly reversible and catalyzed by many lysine acetyltransferases (KATs). The opposing process of acetylation is deacetylation which is governed by histone deacetylases (HDACs). The ε-amino lysine acetylation is a reversible post-translational modification with the potential to rival phosphorylation and plays important roles in diverse physiological and pathological processes. Many studies have been performed on potentials of ε-amino lysine acetylation in carcinogenesis, especially in hematological malignancies. Two HDAC inhibitors, romidepsin (Istodax) and vorinostat (SAHA), have been recently approved by the US FDA to treat skin T cell lymphoma. It is expected that ε-amino lysine acetylation will be the hot spot in research on solid tumors and non-tumor diseases. Following is a review regarding the role of lysine acetylation in the pathogenesis of hepatic fibrosis.

Key Words: Lysine acetylation; Liver fibrosis; Hepatic stellate cells; Histone deacetylase inhibitor

0 引言

蛋白质修饰是细胞功能表观遗传学调节的重要环节之一, 包括蛋白质磷酸化、乙酰化、甲基化、糖基化、羟基化、泛素化、SUMO化等. 真核细胞80%-90%的蛋白质(组蛋白和非组蛋白)有乙酰化. 蛋白质乙酰化有3种类型, 即蛋白质N-端α氨基(Nα)乙酰化(不可逆)、ε氨基(Nε)乙酰化(可逆)和O-乙酰化. 第1种是多肽主链上α氨基的乙酰化, 在蛋白翻译过程中完成, 与保护蛋白质不受降解, 维持蛋白质功能有关; 第2种即本文要讨论的蛋白K乙酰化; O-乙酰化是酪氨酸/丝氨酸/苏氨酸羟基的乙酰化, 为近年发现的另一个具有重要调节作用的蛋白乙酰化[1-4]. 用高分辨率质谱检出肝脏中K乙酰化蛋白质高达1 047个, 除组蛋白外, K乙酰化还涉及与染色质重构、DNA复制、DNA修复有关的蛋白、转录因子和转录调节因子、信号转导中的信号分子、凋亡相关蛋白、三大代谢的酶, 一些结构蛋白甚至蛋白乙酰化酶和去乙酰化酶本身. 可见K乙酰化在调节蛋白功能, 继而在调节细胞各种生理和病理过程中起重要作用[5,6].

K乙酰化是在赖氨酸乙酰转移酶(acetyltransferases, KATs)催化下将Acetyl CoA的乙酰基转移到赖氨酸ε位的氨基上, 该过程是可逆的, 在组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases, HDACs)催化下可以去掉赖氨酸的乙酰基.

KATs分A和B两大类, A类位于细胞核, B类位于细胞质. 人及哺乳动物中已鉴定出20余种, 主要有: (1)P300/CBP(CREB-binding protein)家族, 又名KAT3B/KAT3A, 有>75个非组蛋白底物, 为通用的KAT, 与细胞分化与凋亡关系密切, 其变异与癌症发生有关; (2)MYST家族, 有MOF、Tip60(KAT5)、HBO1、 MOZ、MORF等, 与进化有关; (3)GNAT超家族, 包括GcN5L、PCAF(KAT2B)、ElP3、Hat1、ARD1、Eco1、MCM3AP等; (4)TAFⅡ230/250家族, 在人类中是TAFⅡ250, 为TBP(TATA box-binding protein)相关因子, 是转录因子复合体TAFⅡD的组成部分; (5)P160家族, 是一组核受体辅转录激活因子, 有ACTR、SRCI等[7].

近年, KATs的抑制剂已有不少报道, 如抑制P300的有赖氨酰辅酰A、槚如酸(anacardic acid)、聚异丙烯酸化二苯酮(garcinol, 提取于印度藤黄)、姜黄素、白花丹素(plumbagin)、异噻唑啉酮(isothiazolones)、LTK14; 抑制CBP的有槚如酸、聚异丙烯酸化二苯酮、姜黄素和γ-丁内酯(butyrolactones); 抑制PCAF的有H3-CoA-20、槚如酸、聚异丙烯酸化二苯酮、异噻唑啉酮等. 而表没食子酚儿茶素3-没食子酸盐(epigallocatechin3-gallate)对KATs的抑制作用则无明显的选择性[8,9].

组蛋白去乙酰化酶有4组: ClassⅠ, 包括HDAC 1、2、3、8与酵母Rpd3同源. 该组HDAC分子较小, 在40-55 kd间. HDAC 1、2、3位于细胞核内, 他们的底物包括p53、myo-D、STAT-3、E2F1、Rel-A、YY1等. HDAC 8在细胞核和细胞质均有分布, 底物尚不清楚. Class Ⅱ, 与酵母Hda 1同源, 该组HDAC分子较大, 在70-130 kd, 又可分为ClassⅡA(HDAC 4、5、7、9)和ClassⅡB(HDAC 6、10). ClassⅡA在细胞分裂信号的刺激下, 可在质-核之间穿梭, 而ClassⅡB主要位于细胞质. ClassⅡ HDAC对非组蛋白(如GATA-1、GCMa、HP-1、SMAD-7、FLAG-1、-2等)也有去乙酰化作用, 其中HDAC 6是α-微管蛋白和热休克蛋白-90最主要的去乙酰化酶. 因此, HDAC 6与细胞运动有关, 并通过热休克蛋白-90来增强癌基因蛋白, 如: EGFR、RAF-1、ABL的稳定性. Class Ⅲ为SIRT 1-7, 与酵母sir 2基因同源; Class Ⅳ仅有HDAC 11, 实际上是第1、2组HDACs的催化功能域的保守区. 第1、2、4组为依赖Zn+2的金属酶, 属经典的组蛋白去乙酰化酶. 而第3组是NAD+依赖的酶[10].

近年, 寻找HDACs的抑制剂已成为研究热点, 抑制剂按分子结构可分为4类: (1)短链脂肪酸, 有丁酸钠、丙戊酸(valproic acid, VPA)等; (2)氧肟酸类, 常用的是曲古抑菌素(TSA)和辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA), 后者常用作判断抑制效应的金标准. 还有辛二酸双异羟肟酸盐(suberic bishydroxamate, SBHA), m-羧基肉桂酸双异羟肟酸盐(m-Carboxy cinnamic acid bishydroxamate, CBHA)和N-羟基-N'-3-吡啶基辛二酰胺(pyroxamide)等; (3)环形四肽类, 有Trapoxin、Apicidin和FR901128等; (4)苯甲酰胺类, 如4-乙酰氨基-N-(2'-氨基苯基)-苯甲酰胺(CI994)和MS275等, 两者均有抗肿瘤作用. 值得一提的是, VPA对ClassⅠHDACs的抑制效应要强于TSA, 而尼克酰胺, 即Vit. PP, 可抑制ClassⅢ去乙酰化酶(SIRT)[10,11].

K乙酰化与肿瘤发生关系密切, 已有大量报道, 尤其是造血系统肿瘤. 近来, 美国FDA批准HDACs抑制剂romidepsin(Istodax)和vorinostat 用于临床治疗皮肤T细胞淋巴瘤. 但某些实体肿瘤及非肿瘤疾病(如纤维化)中K乙酰化的研究还处于基础研究或初步的临床试验阶段, 现将K乙酰化在肝纤维化发生中的作用及潜在的应用前景的研究进展作一综述.

1 K乙酰化在肝星状细胞激活中的作用

肝纤维化时产生细胞外基质(extracellular matrix, ECM)最主要的细胞是肝星状细胞(hepatic stellate cell, HSC). 十多年前, 已有研究表明, TSA加入分离培养第3天的大鼠HSC培液中, 可部分阻止静止的HSC向肌成纤维细胞转化, 抑制α-SMA表达, 降低Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的产生, 且这种作用可能与组蛋白H4过度乙酰化有关[12]. 另外, 小鼠原代HSC在体外自行激活过程中, ClassⅠHDACs表达的变化有一定规律, 静止时(分离培养4 d前)HDAC 8不表达, 激活开始时(培养4 d)即一直表达; 而HDAC 1、2在HSC静止状态却明显表达, 激活时(培养10 d)则下降甚至不表达; HDAC 3在静止时表达, 激活时仍表达, 其水平不变. 用2.5 mmol/L的VPA从培养第0天开始处理HSC, 可全面抑制培养第4、7、10天时HDAC 1、2、3、8的表达, 同时明显抑制HSC表达α-SMA. EdU掺入标记和免疫细胞化学染色显示, VPA还可抑制HSC的增殖和刺激核内组蛋白H4的乙酰化. 在mRNA水平, VPA可抑制HSC激活的标志物, 如α-SMA、赖氨酸氧化酶(Lox)、分泌磷蛋白1或骨桥蛋白(Spp1)、平滑肌肌球蛋白(Myh11)等的表达[13]. 在硫代乙酰胺(thioacetamide, TAA)小鼠肝纤维化模型中, 与TAA急性肝损伤模型相比, MMP-9、MMP-12、MMP-13和MMP-14的mRNA表达分别下降90%、75%、68%和50%. 同时, 在体外观察到静止的大鼠HSC(原代培养3 d)高表达MMP-9及MMP-13, 激活后(原代培养10 d), 两者明显下降. 激活的大鼠HSC细胞染色质免疫沉淀(ChIP)显示, 在IL-1刺激下, 虽然JNK和ERK信号转导通路处于激活状态, 但下游的转录因子c-Jun以及转录必需的RNA聚合酶Ⅱ却不能很好地与MMP-9及MMP-13基因的启动子结合. ChIP还显示, 与他们启动子相近的组蛋白H4乙酰化水平明显下降, 导致该处染色质构象改变, 阻止转录因子及RNA聚合酶与启动子结合, 从而静默两者的基因. 该过程依赖于组蛋白去乙酰化酶ClassⅡA组中表达增强的HDAC 4的作用[14].

以上实验结果明确了在HSC激活过程中, 蛋白质K乙酰化起重要作用, 其中组蛋白H4的乙酰化改变似乎是关注的焦点.

2 K乙酰化可通过调控TGF-β1信号转导通路影响肝纤维化

转化生长因子β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)信号转导通路的激活是肝纤维化发生机制的关键, 也是HSC激活并维持激活的关键. K乙酰化同样可调控肝脏TGF-β1信号转导通路而影响肝纤维化的发生发展. 如: 用1 mmol/L的VPA(相当于临床用药的血清浓度)作用于人HSC细胞系L190可明显抑制TGF-β1和Ⅰ型胶原mRNA及蛋白水平的表达, 但对L190的增殖却无作用[15].

AMP激活的蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase, AMPK)的激活(如用其激活剂AICAR或metformin)抑制人(LX-2)及大鼠(CFSC-2G)HSC的功能是通过AMPK竞争性抑制TGF-β1信号转导通路中Smad3与赖氨酸乙酰转移酶P300之间的相互作用, 从而抑制Smad3的乙酰化并诱导P300的降解, 由于P300同时是Smad3重要的辅转录因子, 故P300的降解会导致TGF-β1信号转导通路最后阶段促转录功能的失效[16].

上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)可能在肝纤维化发生中起一定作用, EMT分3型: Ⅰ型发生在胚胎发育时期; Ⅱ型是慢性损伤时, 上皮向成纤维细胞样细胞转化; Ⅲ型发生在癌肿浸润转移过程中. 慢性肝损伤时, 部分肝细胞可发生Ⅱ型EMT, 可能是产生ECM细胞的来源之一. TGF-β1信号通路激活是EMT最重要的促进因素, 实验结果显示: 使用不引起细胞凋亡的剂量(400 nmol/L)时, TSA可以抑制TGF-β1诱导的小鼠肝细胞AML12发生EMT, 同时抑制该细胞Ⅰ型胶原基因的表达, 部分恢复该细胞因TGF-β1作用而消失的合成白蛋白的功能. 进一步研究证实: TSA抑制肝细胞TGF-β1信号通路的重要作用点是Smad3, 他不仅抑制Sp-1与磷酸化的Smad3(P-Smad3)结合, 导致Smad3-Sp-1复合物下降, 干预Smad3的促转录活性; 而且下调P300的表达、核转位以及与P-Smad3的结合, 进一步干预Smad3的促转录活性. 根据Ⅰ型胶原基因启动子中Smad3结合元件的寡核苷酸序列合成探针, 对TGF-β1+TSA处理后的AML12肝细胞核提取物进行电泳迁移率变动分析(electrophoresismobilityshift assay, EMSA)和超迁移率变动分析[(supershift assay, SS), 在细胞核提取物中加入相关抗体, 再作EMSA], 结果显示Smad3与Ⅰ型胶原基因启动子的结合受到明显抑制, 该结果有力地印证了上述的TSA抑制TGF-β1信号通路的作用机制[17].

以上资料提示, K乙酰化可通过影响TGF-β1信号转导通路来干预肝纤维化, 其中对Smad3和P300的作用可能是关键点.

3 调控K乙酰化对肝纤维化的干预作用

四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化模型, 在首次注射四氯化碳2 d后, 2次/wk给小鼠饮含0.4% VPA的水, 连续4 wk, 可明显减轻肝纤维化(天狼猩红染+图象分析半定量), 肝组织α-SMA、Ⅰ型胶原、TIMP-Ⅰ的mRNAs的水平明显下降. 但肝功能没有改善[13].

4 结论

蛋白质赖氨酸乙酰化与去乙酰化是组蛋白及非组蛋白重要的修饰机制. 该机制的紊乱参与肿瘤和许多非肿瘤疾病(包括器官纤维化)的发生, 用组蛋白去乙酰化抑制剂治疗肿瘤已取得一些成果. 蛋白质K乙酰化在肝纤维化发生中的作用虽已有一些研究, 然而只是浅层次地接触, 如要全面解决该科学问题, 必须要在3个方面进一步探索: (1)全面完成肝脏主要组成细胞(如肝细胞、库普弗细胞、HSC等)在正常和纤维化状态下蛋白质K乙酰化组学的分析, 尤其是在肝纤维化发生中起关键作用的蛋白质的乙酰化状态; (2)全面了解肝脏主要组成细胞在正常和纤维化状态下HDACs表达谱的改变; (3)研究各种KATs抑制剂及HDACs抑制剂的抑制谱(inhibitory profile). 将来可根据K乙酰化组学和HDACs表达谱提供的信息, 有的放矢地使用这些抑制剂, 以提高防治肝纤维化的疗效, 减轻不良反应.

评论

背景资料

蛋白质赖氨酸乙酰化与去乙酰化是组蛋白及非组蛋白重要的修饰机制. 该机制的紊乱与肿瘤和许多非肿瘤疾病(包括器官纤维化)的发生相关, 用组蛋白去乙酰化抑制剂治疗肿瘤已取得一些成果. 蛋白质K乙酰化在肝纤维化发生中的作用虽已有一些研究, 然只是浅层次地接触, 还有待于进一步的研究.

同行评议者

张小晋, 主任医师, 北京积水潭医院

创新盘点

蛋白乙酰化与实体肿瘤和非肿瘤性疾病发生的关系必将会成为今后研究的热点, 本文对蛋白乙酰化在肝纤维化发生中的作用做了较为全面的阐述.

应用要点

本文对蛋白乙酰化在肝纤维化发生中的作用做了较为全面的阐述, 能够为后续的研究提供一定的理论指导.

同行评价

本文是一篇以基础研究为主的综述, 文章内容及参考文献较新, 结论明确, 具有一定的指导意义.

备注

编辑:田滢 电编:鲁亚静

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