修回日期: 2012-09-10
接受日期: 2012-10-16
在线出版日期: 2012-10-28
目的: 探讨加味四逆散(jiaweisinisan, JWSNS)对身心应激大鼠胃黏膜的保护作用及其机制.
方法: 大鼠随机分为正常组、模型组、JWSNS大、中、小剂量组及奥美拉唑组, 采用慢性心理性应激方法建立应激性胃溃疡大鼠模型, 经JWSNS等干预后评估胃黏膜溃疡指数(ulcer index, UI), 常规HE(hematoxylin and eosin stain, HE)染色镜下观察胃黏膜形态学改变, 透射电镜法观察腺胃区胃黏膜组织细胞及细胞间连接的超微结构改变, 放射免疫法检测大鼠胃组织中胃泌素(gastrin, GAS)及血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide, VIP)水平并用RT-PCR法检测胃组织GASR、空肠组织VIPR2 mRNA表达变化.
结果: 与模型组比较, 正常组、JWSNS中、大、小剂量组及奥美拉唑组大鼠胃黏膜溃疡指数(分)明显减小(0.32±1.58、8.50±3.88、4.67±3.08 vs 25.33±4.33, P<0.01; 13.70±2.26、12.00±2.73 vs 25.33±4.33, P<0.05); 与奥美拉唑组比较, JWSNS中、大剂量组胃黏膜溃疡指数明显减小(P<0.05, P<0.01); 胃黏膜HE染色结果显示模型组大鼠胃黏膜弥漫出血、溃疡糜烂, 较正常组损伤明显, JWSNS大、中、小剂量组大鼠胃黏膜损伤较模型组不同程度减轻. 电镜观察显示正常组大鼠胃黏膜上皮细胞间连接紧凑, 胞膜完整, 胞核形态及大小正常; 模型组大鼠胃黏膜上皮细胞间连接松解, 胞质中细胞器及胞核受损严重, 染色质明显边集、浓缩或均一化分布; 其余治疗组均较模型组不同程度好转. 与模型组比较, 正常组、JWSNS中、大剂量组、奥美拉唑组、JWSNS小剂量组大鼠胃窦组织中GAS含量显著增高(39.23±5.54、27.52±4.28、38.27±4.18、28.30±5.53 vs 8.33±4.63, P<0.01; 15.74±4.56 vs 8.33±4.63, P<0.05), 与奥美拉唑组比较, JWSNS大剂量组胃窦组织中GAS含量增高(P<0.05); 与模型组比较, 正常组、JWSNS大、中剂量组及奥美拉唑组大鼠胃窦组织中VIP含量降低(36.32±1.68、39.67±2.98 vs 89.33±4.43, P<0.01; 60.50±3.85、59.00±2.89 vs 89.33±4.43, P<0.05), 与奥美拉唑组比较, JWSNS大剂量组胃窦组织中VIP含量降低(P<0.05); 与模型组比较, 正常组、JWSNS中、大、小剂量组及奥美拉唑组胃组织GASR mRNA表达均升高(1.00±0.10、0.53±0.03、0.62±0.05 vs 0.19±0.05, P<0.01; 0.25±0.02、0.43±0.03 vs 0.19±0.05, P<0.05), 正常组、JWSNS大、中、小剂量组及奥美拉唑组空肠组织VIPR2 mRNA表达则降低(1.00±0.20、1.15±0.33 vs 3.40±0.57, P<0.01; 1.83±0.30、2.39±0.36、1.79±0.35 vs 3.40±0.57, P<0.05); 与奥美拉唑组比较, JWSNS大剂量组胃组织GASR mRNA表达明显升高(P<0.05), 而JWSNS大剂量组空肠组织VIPR2 mRNA表达则明显降低(P<0.01).
结论: JWSNS对身心应激大鼠胃黏膜有较好的保护作用.
引文著录: 谢慧臣, 刘芬, 杨强, 熊常初. 加味四逆散对身心应激大鼠胃黏膜形态学的作用机制. 世界华人消化杂志 2012; 20(30): 2873-2881
Revised: September 10, 2012
Accepted: October 16, 2012
Published online: October 28, 2012
AIM: To study the protective effect of Jiaweisinisan (JWSNS) on the gastric mucosa of rats following physical and mental stress and to explore the possible mechanisms involved.
METHODS: Rats were randomly divided into normal group, model group, low-, medium-, and high-dose JWSNS groups, and omeprazole group. Gastric ulcer was induced in rats using a chronic psychological stress method. After JWSNS intervention, gastric juice pH value was measured, mucosal ulcer index (UI) was evaluated, morphological and ultrastructural changes in gastric tissue were observed by light microscopy and transmission electron microscopy. The levels of gastrin (GAS) and vasoactive intestinal peptide (VIP) in gastric tissue were determined by immunoradiometric assay, and mRNA expression of GASR in gastric and VIPR2 in jejunal tissue was detected by RT-PCR.
RESULTS: Compared to the model group, gastric UI was significantly lower in the normal group, low-, medium-, and high-dose JWSNS groups, and omeprazole group (0.32 ± 1.58, 13.70 ± 2.26, 8.50 ± 3.88, 4.67 ± 3.08, 12.00 ± 2.73 vs 25.33 ± 4.33, all P < 0.05). Compared to the omeprazole group, gastric UI was significantly lower in the medium- and high-dose JWSNS groups (both P < 0.05). The gastric mucosa of rats in the model group showed obvious injury compared to the normal group. Varying degrees of relief of gastric mucosa injury was observed in the JWSNS groups. Treatment with JWSNS also significantly improved ultrastructural changes in gastric tissue. Compared to the model group, levels of GAS in the gastric antrum were significantly higher in the normal group, low-, medium-, and high-dose JWSNS groups, and omeprazole group (39.23 ± 5.54, 15.74 ± 4.56, 27.52 ± 4.28, 38.27 ± 4.18, 28.30 ± 5.53 vs 8.33 ± 4.63, all P < 0.05). Compared to the omeprazole group, levels of GAS in the gastric antrum were significantly higher in the high-dose JWSNS group (P < 0.05). Compared to the model group, levels of VIP in the gastric antrum were significantly lower in the normal group, medium-, and high-dose JWSNS groups, and omeprazole group (36.32 ± 1.68, 60.50 ± 3.85, 39.67 ± 2.98, 59.00 ± 2.89 vs 89.33 ± 4.43, all P < 0.05). Compared to the omeprazole group, levels of VIP in the gastric antrum were significantly lower in the high-dose JWSNS group (P < 0.05). Compared to the model group, expression of GASR mRNA in gastric tissue increased significantly (1.00 ± 0.10, 0.25 ± 0.02, 0.53 ± 0.03, 0.62 ± 0.05, 0.43 ± 0.03 vs 0.19 ± 0.05, all P < 0.05) and that of VIPR2 mRNA in jejunal tissue decreased significantly (1.00 ± 0.20, 1.83 ± 0.30, 2.39 ± 0.36, 1.15 ± 0.33, 1.79 ± 0.35 vs 3.40 ± 0.57, all P < 0.05) in the normal group, low-, medium-, and high-dose JWSNS groups, and omeprazole group. Compared to the omeprazole group, expression of GASR mRNA in gastric tissue increased significantly (P < 0.05) and that of VIPR2 mRNA in jejunal tissue decreased significantly (P < 0.01) in the high-dose JWSNS group.
CONCLUSION: JWSNS has a good protective effect on the gastric mucosa of rats following physical and mental stress.
- Citation: Xie HC, Liu F, Yang Q, Xiong CC. Effect of Jiaweisinisan on morphology of the gastric mucosa of rats following chronic psychological stress. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2012; 20(30): 2873-2881
- URL: https://www.wjgnet.com/1009-3079/full/v20/i30/2873.htm
- DOI: https://dx.doi.org/10.11569/wcjd.v20.i30.2873
随着社会发展, 人们的生活节奏也越来越快, 伴随各种社会问题不断出现, 且渐趋复杂化, 导致人群弥漫焦虑、急躁, 甚至无所适从感. 应激性心理、生理反应因人们心理情感上的种种变化而不断积累, 导致各种身心疾病的发生, 其中尤以与胃肠道疾病起病及病情的发展关系密切[1], 而应激致病和中医病因学中的情志所伤内在含义是一致的. 通过查阅文献[2], 我们认为中医疏肝理气法的治病机制与该方法对胃肠道黏膜形态结构及胃肠激素水平施加了有益的影响有关, 而胃肠激素的作用效果又与表达的受体的数目关系密切, 即受体水平的高低可很好地反映该激素的作用强度, 但目前相关研究报道较少[3]. 加味四逆散(jiaweisinisan, JWSNS)来源于中医疏肝理气法之经典方四逆散, 前期大量临床观察[4]已证明其对调节患者胃肠功能具有积极作用. 本研究首次从实验角度进一步探索该方对慢性身心应激模型大鼠胃肠激素和相应受体表达及胃黏膜细胞超微结构的影响, 从脑肠肽受体角度探讨了JWSNS调治身心应激相关性胃肠疾病的作用机制.
10-12 wk SPF级♀Wistar大鼠60只, 体质量200 g±20 g, 购自湖北中医药大学动物实验室, 动物使用许可证号SRST(鄂)20110018. JWSNS(柴胡8 g、枳实15 g、白芍15 g、郁金6 g、白芨6 g、砂仁12 g、炙甘草6 g)购自湖北中医药大学附属医院中药房. 按照中药常规煎法制成相当于生药l g/mL的药液, 4 ℃冰箱保存备用. 给药前, 将药液配制成所需浓度. 奥美拉唑片, 山东齐鲁药业有限公司生产, 给药前蒸馏水配制成0.3 mg/mL浓度. GAS、VIP放免试剂盒由南京建成生物工程公司提供, 批号100809、100902. GASR mRNA、VIPR2 mRNA实时荧光定量PCR试剂盒、引物(Invitrogen Biotechnology Co., LTD中国公司), PCR引物序列、产物长度和退火温度见表1. XSP-300型-双目显微镜(上海蔡康光学仪器有限公司); 日立H-600型透射电镜(日本日立公司); LKB-V型超薄切片机(瑞典BROMMA公司); Neofuge15R-台式高速冷冻离心机(Heal Force); DFM-96型多管放射免疫计数器(北京核仪器厂); Life express Thermal Cycler-PCR仪(Hangzhou Bioer Teechnology Co. LTD); SLAN荧光定量PCR检测系统(上海宏石医疗科技有限公司); SW-CJ-1FD-超净工作台(苏净安泰公司).
| 引物名称 | 引物序列(5'-3') | 片段长度(bp) | 退火温度(℃) |
| R-actin-S | CGTTGACATCCGTAAAGACCTC | 110 | 58 |
| R-actin-A | TAGGAGCCAGGGCAGTAATCT | ||
| R-GASR-S | GCGAATGCTGCTAGTGATTGT | 112 | 58 |
| R-GASR-A | CCCTGAGAGTGCTCGTTGTG | ||
| R-Vipr2-S | TACAAGAGGCTCGCCAAGTCC | 195 | 58 |
| R-Vipr2-A | TTTCAGTTCACGCTGTACCTCAC |
1.2.1 模型制备: 按文献[5]采用不可预知慢性应激方法制备大鼠模型, 选10种不可预知刺激因素刺激大鼠. (1)潮湿垫料加倾斜饲养: 以倾斜鼠笼后底部浸水设为垫料的标准潮湿程度, 将鼠笼倾斜至30度以上, 持续24 h; (2)热水泳: 将大鼠放入水温48 ℃左右, 水深35 cm的热水中10 min; (3)禁食24 h; (4)电击: 电刺激的参数以生物机能系统进行调控, 电流控制在0.1 mA、3次/min, 连续刺激15 min; (5)行为束缚2 h: 大鼠以1%戊巴比妥钠(15 mg/kg)腹腔内注射麻醉后仰位捆绑于专用鼠板上, 等待大鼠清醒后计时开始; (6)陌生物品: 随机选择发声的收音机、烧杯、铁丝网等, 放入鼠笼24 h; (7)昼夜交替: 白昼以黑布罩着鼠笼持续12 h, 天黑后拿掉并用白炽灯照射并持续12 h; (8)陌生气味: 将医用棉花蘸取冰醋酸放入玻璃瓶, 瓶口开放, 放入鼠笼并持续24 h; (9)冰水泳: 将受试大鼠放入水温4 ℃, 水深35 cm水中10 min; (10)禁水24 h. 每日于10种刺激方法中随机取一种, 特别注意相邻两天不能重复同一种刺激; 每天上午9:00将刺激更换, 刺激2 wk. 从第15天起, 开始给大鼠灌胃药物, 连续2 wk, 给药同时继续进行刺激.
1.2.2 分组与给药: 大鼠随机分为6组: 正常组、模型组、奥美拉唑组、JWSNS大、中、小剂量组. 实验总耗时共4 wk, 前2 wk除正常组外统一进行造模, 从第3周开始灌胃.
1.2.3 药物配制剂量: 大鼠每日JWSNS用药剂量(中剂量)按等效临床剂量和体表面积公式计算出为5 g/kg, 小剂量为其1/2(2.5 g/kg)浓度和大剂量为其2倍浓度(10 g/kg). 小、中、大剂量组的中药复方药物浓度分别设定为0.25、0.5、1.0 g/mL, 每日将配置好的中药煎剂2 mL灌胃大鼠. 奥美拉唑组灌胃0.3 mg/mL的奥美拉唑混悬液2 mL, 以上药物均用蒸馏水配制. 空白组及模型组灌胃生理盐水2 mL, 均为1次/次直至实验结束, 共灌胃2 wk.
1.2.4 指标检测: (1)胃黏膜溃疡指数(ulcer index, UI)检测: 末次给药后禁食不禁水24 h, 脱颈椎处死大鼠, 开腹取胃洗去胃表面血迹, 将胃壁大弯剪开并外翻黏膜面, 冲洗黏膜面上及胃腔内的污物及血迹, 内面向上平展胃黏膜于洁净纱布上, 用10倍放大镜仔细观察胃黏膜损伤情况, 并仔细记录, 在腺胃区就黏膜出血情况, 点线状糜烂等进行计数, 累积积分评估胃黏膜UI(按Guth标准)[6], 评分标准如下: 1分: 斑点糜烂; 2分: 糜烂长度<1 mm; 3分: 糜烂长度1-2 mm; 4分: 糜烂长度2-3 mm; 5分: 糜烂长度>4 mm; 如病灶宽于2 mm, 以上分数×2, 溃疡指数等于全胃各病灶分数的总和; (2)胃黏膜光镜观察: 于腺胃区黏膜损伤明显处无菌条件下取1块0.5 cm×1.0 cm组织洗净, 用40 g/L甲醛溶液将标本固定48 h, 常规石蜡包埋, 切片, HE染色, 光镜观察胃黏膜组织病变; (3)电镜标本制作及观察: 于腺胃区剪取0.1 cm×0.1 cm大小黏膜组织1块, 2.5%戊二醛前固定, 0.1 mol/L磷酸缓冲液漂洗3次, 锇酸(O3O4, 1%)后固定, 0.1 mol/L磷酸缓冲液漂洗3次, 梯度乙醇脱水(500、700、800、950、1 000 mL/L)2次, 每次15 min, 环氧树脂包埋, 纯丙酮脱水2次(15 min), EPON812∶丙酮(1∶1)浸透30 min, 纯包埋液浸透1 h, 纯包埋液固化37 ℃ 24 h后60 ℃ 48 h, 超薄切片机切片, 铀、铅染色(醋酸双氧铀, 枸橼酸铅), 透射电镜观察胃黏膜组织细胞超微病理改变; (4)胃组织中Gas及VIP水平检测: 取1块胃窦组织0.5 cm×1.0 cm, 生理盐水洗净, 称取质量后于l mL、l00 ℃生理盐水煮沸3 min, 后置于匀浆器中加0.1 mol/L盐酸0.5 mL匀浆, 4 ℃置1 h , 0.1 mol/L的NaOH 0.5 mL中和, 4 ℃, 3 000 r/min离心30 min, 取上清-20 ℃保存, 放射免疫法检测大鼠胃组织中胃泌素(gastrin, GAS)及血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide, VIP)水平, 具体按各试剂盒说明书操作; (5)RT-PCR法测定胃组织GASR、空肠组织VIPR2两种受体mRNA的表达及定量分析: 于胃窦区(距幽门0.5 cm)、空肠区(距幽门2-3 cm)取适量组织, 迅速投入液氮中, 后转入-80 ℃冰箱, RT-PCR法测定胃组织GASR、空肠组织VIPR2两种受体mRNA的表达及定量分析. 按试剂盒说明书进行操作. PCR反应体系为2×qPCR Mix 12.5 μL, 2.5 μmol/L基因引物2.0 μL, 反转录产物2.0 μL, ddH2O 8.5 μL; PCR扩增: 预变性95 ℃, 1 min, 循环(40次)95 ℃, 15 s→58 ℃, 20 s→72 ℃, 20 s, 末段延伸72 ℃, 5 min, 溶解曲线72 ℃→95 ℃, 每20 s升温1 ℃. 结果处理: △△CT法: A = CT(目的基因, 待测样本)-CT(内标基因, 待测样本); B = CT(目的基因, 对照样本)-CT(内标基因, 对照样本); K = A-B, 表达倍数 = 2-K.
统计学处理 用SPSSl7.0软件进行统计学分析, 资料数据以mean±SD表示, 采用单因素方差分析, P<0.05为差异具有统计学意义.
肉眼观察正常对照组大鼠胃壁平整光滑几乎无损伤, 镜下可见大鼠胃黏膜层次清楚, 结构正常, 腺体整齐排列, 黏膜下层毛细血管无扩张淤血(图1A). 模型组大鼠胃黏膜水肿充血严重, 并伴糜烂, 溃疡, 点线状出血, 说明慢性应激性胃溃疡大鼠模型成功. 镜下见胃黏膜大片状脱落及坏死, 红细胞渗出, 淋巴细胞浸润, 连续性黏膜中断, 形成溃疡, 黏膜下层血管明显淤滞(图1B), 其病变与正常对照组相比差异明显. 奥美拉唑组大鼠胃壁平整, 糜烂减轻明显. 镜下见大鼠胃黏膜腺体排列较整齐, 损黏膜表浅局限, 出血较少, 偶见表层小片状脱落上皮(图1C). JWSNS小剂量组大鼠胃壁稍显凸凹不平, 微小溃疡或点线状出血较多见. 镜下见大鼠黏膜层红细胞少量渗出, 腺体排列较紊乱(图1D). JWSNS中剂量组大鼠胃壁欠光滑, 瘀血较轻, 糜烂尚不明显, 镜下见大鼠胃黏膜完整性较好, 腺体排列较整齐, 受损黏膜表浅局限(图1E). JWSNS大剂量组大鼠胃壁光整, 糜烂不明显; 镜下见大鼠胃黏膜腺体整齐排列, 受损部位局限和表浅(图1F).
与模型组比较, 正常组、JWSNS中、大、小剂量组及奥美拉唑组大鼠胃黏膜溃疡指数(ulcer index, UI)明显减小(0.32±1.58、8.50±3.88、4.67±3.08 vs 25.33±4.33, P<0.01; 13.70±2.26、12.00±2.73 vs 25.33±4.33, P<0.05); 与奥美拉唑组比较, JWSNS中, 大剂量组胃黏膜UI明显减小(8.50±3.88 vs 12.00±2.73, P<0.05; 4.67±3.08 vs 12.00±2.73, P<0.01); 与JWSNS小剂量组比较, JWSNS中、大剂量组大鼠胃黏膜UI均显著下降(8.50±3.88 vs 13.70±2.26, P<0.05; 4.67±3.08 vs 13.70±2.26, P<0.01)(表2).
正常组大鼠胃黏膜上皮细胞间连接紧凑, 胞膜完整, 细胞器均匀分布, 线粒体呈静息状态, 内质网无扩张, 胞核形态及大小正常, 核膜完整, 无染色质浓缩、边集等异常(图2A); 模型组大鼠胃黏膜上皮细胞间连接松解, 胞膜结构部分缺失, 胞质中细胞器崩解, 基质透明, 内质网扩张, 线粒体肿胀, 胞核形态极不规则, 大量畸形核, 部分核溶解, 染色质明显边集、浓缩或均一化分布(图2B); 奥美拉唑组大鼠胃黏膜上皮细胞间连接较紧密, 胞膜结构基本完整, 胞浆中细胞器分布欠均匀, 无明显肿胀, 胞核核膜完整, 形态基本正常, 染色质部分边集(图2C); JWSNS小剂量组大鼠胃黏膜上皮细胞部分连接较松散, 胞浆线粒体部分肿胀, 基粒减少, 内质网扩张明显, 核膜尚完整, 部分染色质边集或均一分布, 部分核溶解(图2D); JWSNS中剂量组大鼠胃黏膜上皮细胞间连接较紧密, 胞膜结构基本完整, 胞桨细胞器分布尚均匀, 无明显肿胀, 胞核形态基本正常, 核染色质部分边集, 核表面欠光整(图2E); JWSNS大剂量组大鼠胃黏膜上皮细胞间连接紧密, 胞膜结构完整, 胞浆细胞器结构基本恢复正常, 胞核形态正常, 核膜完整, 染色质无明显浓缩、边集等异常(图2F).
与模型组比较, 正常组、JWSNS中、大剂量组、奥美拉唑组、JWSNS小剂量组大鼠胃窦组织中GAS含量显著增高(39.23±5.54、27.52±4.28、38.27±4.18、28.30±5.53 vs 8.33±4.63, P<0.01; 15.74±4.56 vs 8.33±4.63, P<0.05), 与奥美拉唑组比较, JWSNS大剂量组胃窦组织中GAS含量增高(38.27±4.18 vs 28.30±5.53, P<0.05); 与中药小剂量组比较, 中药中、大剂量组胃窦组织中GAS含量明显升高(27.52±4.28 vs 8.33±4.63, P<0.05, 38.27±4.18 vs 8.33±4.63, P<0.01), 与模型组比较, 正常组、JWSNS大、中剂量组及奥美拉唑组大鼠胃窦组织中VIP含量降低(36.32±1.68、39.67±2.98 vs 89.33±4.43, P<0.01; 60.50±3.85、59.00±2.89 vs 89.33±4.43, P<0.05), 与奥美拉唑组比较, JWSNS大剂量组胃窦组织中VIP含量降低(39.67±2.98 vs 59.00±2.89, P<0.05); 与中药小剂量组比较, 中药中、大剂量组胃窦组织中VIP含量降低(60.50±3.85 vs 89.33±4.43, P<0.05, 39.67±2.98 vs 89.33±4.43, P<0.01)(表3).
实时定量PCR结果显示, 与模型组比较, 正常组、JWSNS中、大、小剂量组及奥美拉唑组胃组织GASR mRNA表达均升高(1.00±0.10、0.53±0.03、0.62±0.05 vs 0.19±0.05, P<0.01; 0.25±0.02、0.43±0.03 vs 0.19±0.05, P<0.05), 正常组、JWSNS大、中、小剂量组及奥美拉唑组空肠组织VIPR2 mRNA表达则降低(1.00±0.20、1.15±0.33 vs 3.40±0.57, P<0.01; 1.83±0.30、2.39±0.36、1.79±0.35 vs 3.40±0.57, P<0.05); 与奥美拉唑组比较, JWSNS大剂量组胃组织GASR mRNA表达明显升高(0.62±0.05 vs 0.43±0.03, P<0.05), 而JWSNS大剂量空肠组织VIPR2 mRNA表达则明显降低(1.15±0.33 vs 1.79±0.35, P<0.01). 与中药小剂量组比较, 中药中、大剂量组胃组织GASR mRNA相对表达量明显升高(0.53±0.03 vs 0.25±0.02, P<0.05; 0.62±0.05 vs 0.25±0.02, P<0.01), 空肠组织VIPR2 mRNA相对表达量明显降低(1.83±0.30 vs 2.39±0.36, P<0.05; 1.15±0.33 vs 2.39±0.36, P<0.01)(表4).
心理应激引发机体产生的生理学效应包括神经内分泌激活、炎症反应和自主神经功能不全等, 最常见的就是急慢性胃炎及消化性溃疡. 有研究表明[7], 急、慢性精神应激导致机体内脏对伤害性刺激的高反应性, 同时伴胃黏膜上皮细胞间隙增宽, 黏膜肥大细胞活化、脱颗粒和黏膜炎性反应. 应激还可致下丘脑-垂体-肾上腺(hypothalamic-pituitary-adrenocortical, HPA)轴活化, 炎性细胞因子水平增加, 诱发消化道急慢性炎性反应、黏膜屏障功能障碍和胃肠神经系统重塑, 从而使患者产生内脏高动力状态或持久疼痛, 肠易激综合征患者可以观察到类似的改变[8]. 而动物应激模型在某种程度上模拟了目前人群越来艰难的生存状况, 在应激研究领域发挥着越来越重要的作用, 对临床药物的筛选和评价, 临床疾病的发生、发展机制以及预后评估都有不可替代的作用. 本实验中, 慢性应激模型大鼠胃黏膜均发生了程度不同的溃疡, 说明应激原的作用对消化系统的影响是确切的, 也说明应激模型是成功的. 有相关研究[9]表明, 应激后大鼠胃酸异常增高, 胃液pH值降低与应激性溃疡发病关系极为密切, 本实验研究发现身心应激模型大鼠肉眼及镜下胃黏膜损伤明显, 另外, 实验结果还发现除一般的病理损伤外, 慢性应激模型大鼠胃黏膜细胞受损, 细胞水肿, 细胞膜破坏, 线粒体肿胀变性, 内质网扩张, 细胞骨架破坏, 核固缩、碎裂、溶解等, 而JWSNS可改善应激大鼠胃黏膜所处的内环境, 减轻胃黏膜损伤状况, 使大鼠受损的胃黏膜细胞超微结构得到修护, 全方表现出较好的胃黏膜细胞保护与修复作用.
脑肠肽存在于中枢神经系统、胃肠道内分泌细胞、肠道神经系统, 具有调节胃肠运动、分泌吸收等复杂的功能, 并受情绪影响[10]. 生理情况下, 脑肠肽调节胃肠运动是通过中枢神经系统及胃肠平滑肌细胞系统完成的. 根据脑肠肽效应的不同, 可将其分为兴奋和抑制两类, 前者常见的有GAS、肠内P物质(substance P, SP)及胆囊收缩素(cholecystokinin, CCK)等, 可致胃肠平滑肌细胞收缩; 后者以VIP、促胰液素及生长抑制素等多见, 可致胃肠平滑肌细胞舒张, 两类肽类物质共同调控胃肠运动[11]. GAS是典型的兴奋性脑肠肽, 分泌自胃窦、十二指肠黏膜开放G细胞, 主要分布于胃肠道, 通过受体介导调节和刺激胃肠运动, 可抑制自发和胃动素(motilin, MTN)等诱发的MMCⅢ(migrating myoelectrical complex, MMC)相活动. VIP主要分布于胃肠道黏膜下、肌间神经丛. 对胃肠道平滑肌运动和消化道内外分泌腺功能都有重要作用. 但需与受体结合才可产生偶联放大效应作用于平滑肌使之舒张[12]. 在应用放射配体结合的研究中发现[13], VIP可引起大鼠胃肠平滑肌细胞呈剂量依赖性舒张. 本实验表明, JWSNS可分别增加和降低应激模型大鼠胃组织中GAS和VIP含量, 增强大鼠的胃蠕动功能, 说明该方具有较好的调节胃组织中脑肠肽含量以及改善胃肠功能的作用.
脑肠肽的作用靶点为细胞表面的特异性受体, 除脑肠肽外, 胃肠功能障碍与脑肠肽受体mRNA的表达水平亦有密切关系. 脑肠肽受体分布于胃肠平滑肌细胞膜上, 亦有兴奋性和抑制性两类. 兴奋性和抑制性脑肠肽分别与相应受体结合, 可使胃肠平滑肌细胞收缩或舒张. GASR、 VIPR2分属于兴奋性和抑制性脑肠肽受体. 现已证实许多疾病的发生与GASR有关[14], 如常见的胃肠动力障碍性疾病、肿瘤、帕金森综合征及精神分裂症疾病等, 而临床研究发现[15]VIPR2与胃肠动力障碍及肿瘤的发生有密切关系. 研究发现[16], GASR可与GAS和CCKB(胆囊收缩素-B)结合调节胃酸分泌和胃肠平滑肌细胞收缩, VIP可与胃肠平滑肌细胞上特异性VIPR结合, 引起胃肠平滑肌细胞的舒张. VIPR分为VIPR1和VIPR2两型, 通过原位杂交和免疫组织化学方法发现VIPR2仅表达在胃和十二指肠且含量较高[17]. 本实验结果显示, 身心应激方法可使GASR mRNA和VIPR2 mRNA基因相对表达量分别降低和升高. 这与脑肠肽含量变化基本一致, 进一步证实了用心身应激方法复制胃肠功能障碍大鼠模型的客观性和可行性. JWSNS可使身心应激模型大鼠胃窦组织中GASR mRNA基因相对表达量升高, VIPR2 mRNA基因相对表达量降低, 说明该方可提高胃窦组织中GASR mRNA阳性细胞表达率, 同时可降低VIPR2 mRNA阳性细胞表达率. 本研究结果JWSNS对脑肠肽和脑肠肽受体都有较好的调节作用, 提示JWSNS在胃肠道运动中具有多靶点的整体调治作用, 但是JWSNS调节脑肠肽及相关受体mRNA表达的详细途径还需进一步探讨.
中医学中, 应激性胃溃疡归属于胃痞范畴, 其机制多是由于禀赋、情志、饮食等失常致使脾胃气机不畅, 升降失司所致. 其表在胃, 但其本在肝脾. JWSNS源于张仲景的经典名方四逆散, 原方四逆散由枳实、芍药、柴胡、炙甘草组成, 主治肝气内郁、气机不畅之气逆证. 经后世医家的不断发展, 使该方的应用范围逐渐扩大, 成为调畅气机法的中医代表方剂, 凡外感或内伤杂病, 有气机不畅之病机, 即可加减化裁而用之. 而应激性胃肠功能紊乱和胃黏膜损伤除有气机郁滞的基本病机外, 湿滞血瘀, 脾胃受损也是常见的病机[18]. 因此, 我们根据目前的临床实际, 在原方调畅气机法的基础上辅以祛湿活血之药组成JWSNS. 方中以疏肝理气之柴胡、枳实为君, 臣以白芍、砂仁、白芨柔肝健脾和胃、行气调中祛湿、兼以收敛, 佐以郁金行气活血解郁, 使以炙甘草调和诸药、补脾益气. 近年来, 许多研究证明[19,20]白芍、砂仁等能明显促进胃排空、小肠推进, 如白芍甘草汤, 有研究表明其有很好的胃黏膜保护作用并可调节胃肠功能. 而其中的甘草是最广泛应用的一味中药, 甘草中所含的许多成分具有抑酸, 缓解痉挛, 预防或修复溃疡等的作用. 从上述JWSNS对慢性应激胃溃疡模型大鼠胃黏膜组织细胞超微结构及脑肠肽受体的干预作用可推测, JWSNS可使肝气正常升发, 津血能正常地输布五脏六腑, 使脾有所充、脑有所养, 中枢神经系统和局部脑肠肽调节平衡, 从而施治于相关应激性胃肠疾病, 组方真正体现了中医身心兼顾、标本同治的理念. 该实验研究的结果为JWSNS的临床推广提供了理论依据, 下一步将结合药理实验对该方进行中药化学成分及分子生物学领域的细致研究, 力争知晓有效化学成分的具体结构及作用机制, 从基因水平上探讨该方抗应激的作用机制, 这也是未来研究的主要方向之一.
随着社会环境和生活方式的改变, 工作生活压力的增加, 心理应激参与疾病的发生、发展得到广泛重视. 应激性胃黏膜损伤是一种临床常见的以胃黏膜糜烂、溃疡、出血为特征的身心应激并发症. 近年来对于其发病机制的探讨日渐深入, 研究表明应激性胃黏膜损伤是由多因素共同作用的结果.
曹志成, 英国生物医学科学研究所院士, 香港伊利沙伯医院临床肿瘤部、肿瘤研究科
应激性胃黏膜损伤是由于各种急慢性应激致胃黏膜保护与损伤机制失衡引起的, 以溃疡或糜烂为特征的严重并发症.目前中西医相关研究多集中在神经内分泌失调、胃黏膜屏障保护、保护及损伤因子失衡、细胞凋亡等方面, 但因其发病机制复杂,故尚未完全阐明.
相关文献中提到应激性胃黏膜损伤与下丘脑-垂体-肾上腺、HPA轴、交感-肾上腺髓质系统失调, 胃黏膜血流量异常, 胃黏膜屏障受损, 胃黏膜保护性物质前列腺素、表皮生长因子等减少, 胃酸异常分泌, 应激抑制免疫系统, 氧自由基损伤, 凋亡等因素均有关系.
本研究首次从实验角度探索加味四逆散(JWSNS)验方对慢性身心应激模型大鼠胃肠激素及相应受体表达和胃黏膜细胞超微结构的影响, 以期从脑肠肽受体角度探讨JWSNS调治身心应激相关性胃肠疾病的作用机制.
中医学中, 应激性胃溃疡归属胃痞范畴, 其表在胃, 但其本在肝脾. 根据目前临床实践, 在原方四逆散调畅气机法基础上辅以祛湿活血之药组成加味四逆散. 该方对胃黏膜组织细胞超微结构及脑肠肽受体有较好干预作用, 组方真正体现了中医身心兼顾、标本同治的理念.
脑肠肽: 在胃肠和神经系统双重分布, 调节胆囊和胆管运动的激素, 包括胃动素、胆囊收缩素和促胰液素等. 脑肠肽不仅在外周广泛地调节着胃肠道的各种功能, 而且在中枢也参与对胃肠道生理活动的调节.
本研究建立和发展了应激性动物模型, 从中医药与现代医学相结合的角度对身心应激致病进行了综合、多系统的研究, 对临床应用具有一定的指导意义.
编辑:翟欢欢 电编:闫晋利
| 3. | Andersen BL, Cyranowski JM, Espindle D. Men's sexual self-schema. J Pers Soc Psychol. 1999;76:645-661. [PubMed] [DOI] |
| 7. | Pateder DB, Eliseev RA, O'Keefe RJ, Schwarz EM, Okunieff P, Constine LS, Puzas JE, Rosier RN. The role of autocrine growth factors in radiation damage to the epiphyseal growth plate. Radiat Res. 2001;155:847-857. [PubMed] [DOI] |
| 8. | Videlock EJ, Adeyemo M, Licudine A, Hirano M, Ohning G, Mayer M, Mayer EA, Chang L. Childhood trauma is associated with hypothalamic-pituitary-adrenal axis responsiveness in irritable bowel syndrome. Gastroenterology. 2009;137:1954-1962. [PubMed] [DOI] |
| 10. | Taché Y, Bonaz B. Corticotropin-releasing factor receptors and stress-related alterations of gut motor function. J Clin Invest. 2007;117:33-40. [PubMed] [DOI] |
| 11. | Elsenbruch S, Lucas A, Holtmann G, Haag S, Gerken G, Riemenschneider N, Langhorst J, Kavelaars A, Heijnen CJ, Schedlowski M. Public speaking stress-induced neuroendocrine responses and circulating immune cell redistribution in irritable bowel syndrome. Am J Gastroenterol. 2006;101:2300-2307. [PubMed] [DOI] |
| 12. | King D. Why changing the guard is bracing break with tradition. Health Soc Serv J. 1979;89:974-976. [PubMed] |
| 13. | Duff GC, Galyean ML. Board-invited review: recent advances in management of highly stressed, newly received feedlot cattle. J Anim Sci. 2007;85:823-840. [PubMed] [DOI] |
| 15. | Jones MP, Crowell MD, Olden KW, Creed F. Functional gastrointestinal disorders: an update for the psychiatrist. Psychosomatics. 2007;48:93-102. [PubMed] [DOI] |
| 16. | Dinan TG, Quigley EM, Ahmed SM, Scully P, O'Brien S, O'Mahony L, O'Mahony S, Shanahan F, Keeling PW. Hypothalamic-pituitary-gut axis dysregulation in irritable bowel syndrome: plasma cytokines as a potential biomarker? Gastroenterology. 2006;130:304-311. [PubMed] [DOI] |
| 18. | 刘 洁莹, 张 莉华, 方 步武, 王 成, 吴 咸中. 理气开郁法板块方对慢性应激大鼠胃及下丘脑胃动素的影响. 中国中西医结合外科杂志. 2009;15:166-169. |