研究快报 Open Access
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世界华人消化杂志. 2012-01-28; 20(3): 215-218
在线出版日期: 2012-01-28. doi: 10.11569/wcjd.v20.i3.215
槲皮素对人胃癌细胞侵袭和MMP-2表达的影响
王晓燕, 张尤历, 张恒, 祁卫东, 范钰
王晓燕, 张尤历, 江苏大学附属医院消化内科 江苏省镇江市 212001
张恒, 祁卫东, 范钰, 江苏大学附属人民医院肿瘤研究所 江苏省镇江市 212002
王晓燕, 医学硕士, 副主任医师, 主要从事消化系肿瘤防治的研究.
基金项目: 江苏大学临床医学科技发展基金资助项目, No. JLY20080002; 镇江市社会发展基金资助项目, No. SH2009014.
作者贡献分布: 王晓燕与范钰此文所作贡献均等; 此课题由张尤历设计; 实验过程由王晓燕与张恒操作完成; 数据分析由祁卫东完成; 本论文写作由王晓燕完成.
通讯作者: 范钰, 主任医师, 212002, 江苏省镇江市电力路8号, 江苏大学附属人民医院肿瘤研究所. yuf36@sina.com
电话: 0511-88915233
收稿日期: 2011-12-19
修回日期: 2012-01-05
接受日期: 2012-01-19
在线出版日期: 2012-01-28

目的: 观察槲皮素(Quercetin, Que)对人胃癌细胞侵袭的影响, 并探讨其可能机制.

方法: 采用不同浓度的槲皮素处理胃癌BGC-823细胞后, 以软琼脂集落培养试验检测癌细胞锚着不依赖性增殖, 以Boyden小室模型方法检测癌细胞侵袭能力, 采用荧光实时定量PCR检测癌细胞基质金属蛋白酶-2(matrix metallopeptidase-2, MMP-2)基因mRNA水平, 以Western blot方法检测癌细胞MMP-2基因蛋白水平变化.

结果: 不同浓度的胃癌BGC-823细胞经槲皮素处理后, 恶性增殖和侵袭能力均明显下降, 且呈剂量依赖性(P<0.005, P<0.005). 槲皮素处理组MMP-2基因mRNA和蛋白水平均明显下调, 且呈时间和浓度依赖性, 即随着作用时间的延长和槲皮素作用浓度的增加, MMP-2的mRNA和蛋白水平逐渐下降, 差异均有统计学意义(P<0.001, P<0.001).

结论: 槲皮素可明显抑制胃癌BGC-823细胞侵袭能力, 其机制可能与下调MMP-2基因表达有关.

关键词: 胃肿瘤; 槲皮素; 侵袭; 基质金属蛋白酶-2
引文著录: 王晓燕, 张尤历, 张恒, 祁卫东, 范钰. 槲皮素对人胃癌细胞侵袭和MMP-2表达的影响. 世界华人消化杂志 2012; 20(3): 215-218
Quercetin reduces cell invasion and down-regulates matrix metallopeptidase 2 expression in human gastric cancer cell line BGC-823
Xiao-Yan Wang, You-Li Zhang, Heng Zhang, Wei-Dong Qi, Yu Fan
Xiao-Yan Wang, You-Li Zhang, Department of Gastroenterology, the Affiliated Hospital of Jiangsu University, Zhenjiang 212001, Jiangsu Province, China
Heng Zhang, Wei-Dong Qi, Yu Fan, Cancer Institute, the Affiliated People's Hospital of Jiangsu University, Zhenjiang 212002, Jiangsu Province, China
Supported by: the Clinical Medical Science and Technology Development Foundation of Jiangsu University, No. JLY20080002; the Social Development Project Foundation of Zhenjiang City, No. SH2009014
Correspondence to: Yu Fan, Associate Chief Physician, Cancer Institute, the Affiliated People's Hospital of Jiangsu University, No.8 Dianli Road, Zhenjiang 212002, Jiangsu Province, China. yuf36@sina.com
Received: December 19, 2011
Revised: January 5, 2012
Accepted: January 19, 2012
Published online: January 28, 2012

AIM: To investigate the effect of quercetin on the migration of human gastric cancer BGC-823 cells and to explore possible mechanisms involved.

METHODS: After BGC-823 cells were treated with different doses of quercetin, the anchorage-independent growth of cells was evaluated by colony formation assay, cell invasion ability was determined by Boyden chamber assay, and the mRNA and protein expression of matrix metallopeptidase-2 (MMP-2) was detected by real-time RT-PCR and Western blot, respectively.

RESULTS: Quercetin reduced the invasion ability and anchorage-independent growth of BGC-823 cells in a dose-dependent manner (P < 0.005, P < 0.005). Treatment with quercetin down-regulated MMP-2 mRNA and protein expression in a time- and dose-dependent manner (P < 0.001, P < 0.001).

CONCLUSION: Quercetin inhibits the invasion of human gastric carcinoma cell line BGC-823 possibly by down-regulating MMP-2 expression.

Key Words: Gastric carcinoma; Quercetin; Invasion; Matrix metallopeptidase 2
0 引言

胃癌是最常见的恶性肿瘤之一, 发病率和死亡率很高, 严重威胁着人们的健康, 寻找有效且不良反应小的抗癌药物具有重要意义. 作为一种天然的黄酮类化合物, 槲皮素(quercetin, Que)广泛分布于水果、蔬菜及常见中草药之中. 许多研究结果显示, 槲皮素可抑制多种恶性癌细胞如白血病、肺癌、肝癌、卵巢癌、膀胱癌、大肠癌等恶性增殖[1-5], 抑制黑色素瘤、前列腺癌等癌细胞的恶性侵袭[6-10], 说明该药是颇具应用前景的抗癌药物之一, 但该药物对消化系肿瘤细胞侵袭的研究甚少. 本研究采用槲皮素处理人胃癌BGC-823细胞, 观察其对癌细胞侵袭和基质金属蛋白酶-2(matrix metallopeptidase-2, MMP-2)基因表达的影响, 以了解其可能的分子机制.

1 材料和方法
1.1 材料

槲皮素购自美国Sigma公司, 用二甲基亚砜(DMSO)配成储液, -20 ℃冰箱保存; 实验时用RPMI 1640培养基稀释, DMSO的最终浓度小于0.9%; 人胃癌细胞株BGC-823购自中科院上海细胞所细胞库, 江苏大学附属人民医院肿瘤组织血液生物标本库冻存; TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司; BCA蛋白分析试剂盒购自Pierce公司; 基底膜胶(Matrigel)购自BD公司; RPMI 1640、新生小牛血清均购自Gibco公司.

1.2 方法

1.2.1 癌细胞培养及处理: 人胃癌BGC-823细胞置含100 mL/L胎牛血清的RPMI-1640液中, 于37 ℃、CO2培养箱中培养. 每日观察, 待细胞至对数生长期, 采用不同浓度(5、10、20 μmol/L)的槲皮素处理后, 以RPMI-1640代替槲皮素处理细胞作为空白对照组, 备测.

1.2.2 软琼脂集落培养试验: 根据文献[11]方法进行. 倒置显微镜下随机计数每组样品10个视野中的集落个数, 取其平均数作比较, 以此代表胃癌细胞增殖力. 结果采用t检验分析.

1.2.3 体外侵袭抑制试验: 根据文献[12]方法进行. Boyden小室的上、下室之间隔以孔径为8 μm的聚碳酸酯膜, 膜上铺匀1:4稀释的基底膜胶(Matrigel). 下室加预先制备的NIH 3T3细胞培养上清液600 μL作为趋化因子, 上室加入100 μL待测的癌细胞悬液. 置于37 ℃、50 mL/L CO2培养箱中温育24 h, 弃去上室液体, 取出聚碳酸酯膜, 用棉签仔细擦尽膜上Matrigel及未穿过的细胞, 甲醛固定5 min, HE染色. 200倍光镜下计数穿过聚碳酸酯膜的细胞数, 以侵袭细胞的相对数目表示肿瘤细胞侵袭能力. 随机计数5个视野内的细胞数, 取平均值进行统计处理.

1.2.4 MMP-2基因mRNA水平检测: 分别用不同浓度(5、10、20 μmol/L)的槲皮素处理胃癌BGC823细胞24、48、72 h后, 收集细胞, 用TRIzol提取总mRNA, 并进行cDNA合成, 根据文献[13]方法及条件, 采用荧光实时定量PCR检测MMP-2基因mRNA水平并进行数据分析. MMP-2: 上游引物5'-CCGCCTTTAACTGGAGCAAA-3', 下游引物5'-TTTGGTTCTCCAGCTTCAGG-3'; 内参基因GAPDH: 上游引物5'-TTGGTATCGTGGAAGGACTCA-3', 下游引物5'-TGTCATCATATTTGGCAGGTTT-3'. PCR反应条件为: 95 ℃, 预变性3 min, 95 ℃, 30 s; 52 ℃, 45 s; 72 ℃, 45 s; 35 个循环后, 72 ℃再延伸7 min.

1.2.5 MMP-2基因蛋白水平检测: 提取各组癌细胞总蛋白, 对蛋白定量后进行常规Western blot方法检测各组蛋白水平. 利用Kodak Digital Science 1D Image Analysis Software (Eastman Kodak Company, USA)测定各条带净灰度值, 并与内参照β-actin的测定结果相比较, 计算其比值.

统计学处理 采用SPSS11.5统计软件包进行统计学处理, 所得到的数值均以mean±SD表示. P<0.05为差异有统计学意义.

2 结果
2.1 槲皮素对胃癌细胞软琼脂集落形成的影响

胃癌BGC-823细胞在体外半固体培养体系中可自发形成集落, 但经槲皮素处理后, 所形成的集落数明显减少. 统计学分析提示, 集落生长数呈浓度依赖性减少(P<0.005, 图1).

图1
图1 槲皮素对胃癌细胞软琼脂集落形成的影响.
2.2 槲皮素对胃癌细胞侵袭的影响

收集经槲皮素处理的细胞, 采用Boyden小室检测癌细胞侵袭情况. 经统计学分析发现, 槲皮素对胃癌细胞侵袭抑制与浓度相关(P<0.005, 图2).

图2
图2 槲皮素对胃癌细胞侵袭的影响.
2.3 槲皮素对胃癌细胞MMP-2基因表达的影响

胃癌BGC-823细胞经槲皮素处理后, 分别于不同时间(24、48和72 h)收集细胞, 提取RNA和蛋白后, 进行相关检测. 结果显示, 随着作用时间的延长和药物浓度的增加, 经槲皮素处理各组细胞的MMP-2 mRNA和蛋白水平均明显降低(P<0.005, P<0.005, 图3, 4).

图3
图3 槲皮素对胃癌细胞mRNA水平的影响.
图4
图4 槲皮素对胃癌细胞蛋白水平的影响. A: 不同作用时间和不同作用浓度的槲皮素对MMP-2蛋白表达的影响; B:不同浓度槲皮素作用48 h后MMP-2蛋白的表达差异.
3 讨论

肿瘤细胞在软琼脂形成集落的多少可反映肿瘤细胞锚着不依赖性增殖的特性, 且与其恶性程度呈正相关. 癌细胞侵袭能力强, 则在软琼脂上形成的集落数目多. 本研究发现, 胃癌BGC823细胞经不同浓度槲皮素处理后, 软琼脂集落数明显减少, 且呈浓度依赖性(P<0.005). 癌细胞侵袭、转移是一个复杂的过程. 一旦肿瘤细胞从原发肿瘤上脱落, 将侵入宿主的细胞外基质, 然后穿透淋巴管和血管, 进行远处转移. 在此过程中, 肿瘤细胞侵袭细胞外基质是重要的步骤. 在体外侵袭实验中, 我们发现BGC-823细胞具有较强的侵袭能力, 而经槲皮素处理后, 其穿过聚碳酸脂膜的细胞数量减少, 且呈浓度依赖性(P<0.005). 由此说明, 槲皮素可抑制胃癌BGC823细胞的恶性侵袭能力.

MMP是一组锌离子依赖性肽链内切酶, 主要由肿瘤细胞和肿瘤周边间质细胞产生, 几乎能降解细胞外基质的所有成分, 通过对细胞外基质的重塑促进肿瘤新生血管的生成, 从而实现肿瘤的侵袭和转移. MMP-2是该家族中重要成员之一, 能特异性降解细胞外基质和基底膜中的主要成分-Ⅳ型胶原, 使基底膜丧失完整性. 研究发现, 胃癌组织中MMP-2表达与淋巴结转移和浸润深度密切相关, 且MMP-2的表达情况可以作为评估患者预后的参考指标[14-16]. 本研究发现, 槲皮素组MMP-2基因mRNA和蛋白水平均受到抑制, 且与时间和浓度相关(P<0.005; P<0.005).

总之, 槲皮素可抑制胃癌细胞体外恶性增殖和侵袭能力, 其机制可能与下调MMP-2基因表达有关, 但其具体的内在作用机制值得进一步深入研究.

评论
背景资料

胃癌发病率和死亡率很高, 严重威胁着人们的健康, 寻找有效且不良反应小的抗癌药物具有重要意义. 槲皮素(quercetin, Que)是颇具应用前景的抗癌药物之一, 但该药物对消化系肿瘤细胞侵袭的研究甚少.

同行评议者

沈克平, 主任医师, 上海中医药大学附属龙华医院

相关报道

槲皮素可抑制多种恶性癌细胞如白血病、肺癌、肝癌、卵巢癌、膀胱癌、大肠癌等恶性增殖, 抑制黑色素瘤、前列腺癌等癌细胞的恶性侵袭, 但该药物对消化系肿瘤细胞侵袭的研究甚少.

创新盘点

以槲皮素为工具, 从基质金属蛋白质酶角度了解其抑制癌细胞侵袭的分子机制.

同行评价

本研究初步探讨了槲皮素对胃癌细胞侵袭及MMP2表达的作用, 有一定科学意义.

编辑:张姗姗 电编:闫晋利

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