研究快报 Open Access
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世界华人消化杂志. 2012-01-18; 20(2): 140-144
在线出版日期: 2012-01-18. doi: 10.11569/wcjd.v20.i2.140
白介素-18在急性胰腺炎大鼠中性粒细胞凋亡中的作用
吴彦彦, 许兰涛
吴彦彦, 苏州大学研究生部 江苏省苏州市 215021
许兰涛, 上海交通大学附属第六人民医院奉贤分院消化科 上海市 201400
基金项目: 上海市卫生局基金资助项目, No. 2009226.
作者贡献分布: 此课题由吴彦彦与许兰涛设计; 研究过程由吴彦彦完成; 研究所用试剂由许兰涛提供; 论文数据分析由吴彦彦完成; 论文写作由吴彦彦与许兰涛完成.
通讯作者: 许兰涛, 主任医师, 201400, 上海市, 上海交通大学附属第六人民医院奉贤分院消化科. sccdlx@sohu.com
电话: 021-57420713
收稿日期: 2011-11-10
修回日期: 2011-12-01
接受日期: 2011-12-23
在线出版日期: 2012-01-18

目的: 探讨白介素-18(IL-18)在重症急性胰腺炎(SAP)时外周血中性粒细胞(PMN)凋亡中的作用.

方法: SD大鼠60只, 随机分为2组, 每组30只, 分别建立大鼠急性坏死性胰腺炎组(ANP)及假手术组(SO)模型, 在制模后3、6、12 h分期分批处死大鼠, 抽取下腔静脉血测定血淀粉酶含量及血清中IL-18的含量, 作中性粒细胞分离并检测外周血中性粒细胞凋亡率; 同时对大鼠胰腺组织行病理切片HE染色, 并对胰腺组织进行病理评分.

结果: ANP组中性粒细胞(PMN)凋亡率较SO组明显降低, 并随着时间的延长逐渐明显(P<0.01), 至术后12 h降至2.15%±0.45%; ANP组血清中IL-18的含量较SO组明显升高, 而且随着时间的延长更明显(P<0.01), 在12 h达到4705.70±296.30; ANP组PMN的凋亡率与血清中IL-18的水平呈负相关(r = -0.78, P<0.01).

结论: ANP组外周血PMN的凋亡明显延迟, 血清中IL-18的含量明显增高, IL-18可能在急性胰腺炎外周血的PMN凋亡中发挥作用.

关键词: 白介素-18; 急性胰腺炎; 中性粒细胞; 凋亡
引文著录: 吴彦彦, 许兰涛. 白介素-18在急性胰腺炎大鼠中性粒细胞凋亡中的作用. 世界华人消化杂志 2012; 20(2): 140-144
Role of IL-18 in peripheral neutrophil apoptosis in rats with sever acute pancreatitis
Yan-Yan Wu, Lan-Tao Xu
Yan-Yan Wu, Graduate School, Soochow University, Suzhou 215006, Jiangsu Province, China
Lan-Tao Xu, Fengxian Branch of the Sixth Affiliated Hospital of Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 201400, China
Supported by: the Foundation of Shanghai Municipal Health Bureau, No. 2009226
Correspondence to: Lan-Tao Xu, Chief Physician, Fengxian Branch of the Sixth Affiliated Hospital of Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 201400, China. sccdlx@sohu.com
Received: November 10, 2011
Revised: December 1, 2011
Accepted: December 23, 2011
Published online: January 18, 2012

AIM: To examine the role of interleukin-18 (IL-18) in apoptosis of peripheral blood neutrophils (PMNs) in rats with severe acute pancreatitis (SAP).

METHODS: Sixty SD rats were randomly divided into two groups: SAP group and sham operation (SO) group. At 3, 6 and 12 h after SAP induction, blood samples were collected from the inferior vena cava to measure serum amylase and IL 18; PMNs were separated to detect their apoptosis; and pancreatic specimens were taken for pathological examination.

RESULTS: PMN apoptosis rate decreased remarkably in the SAP group than in the SO group, and the decrease became more obvious over time (P < 0.01). Serum levels of IL-18 in the SAP group increased significantly compared with those in the SO group (P < 0.01). There was a negative correlation between the apoptosis rate of PMNs and serum levels of IL-18 in SAP rats (r = -0.742, P < 0.01).

CONCLUSION: Compared to control rats, PMN apoptosis was obviously delayed and serum levels of IL-18 remarkably increased in SAP rats, indicating that IL-18 may play an important role in peripheral neutrophil apoptosis in SAP.

Key Words: Interleukin-18; Severe acute pancreatitis; Neutrophils; Apoptosis
0 引言

重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)是一个死亡率极高的疾病, 其发病机制复杂. 白介素-18(interleukin-18, IL-18)是一个新发现的促炎症细胞因子, 属于IL-1细胞因子超家族. 近年来, 有学者研究发现, IL-18可以延迟酒精中毒和烧伤患者中外周血中性粒细胞(polymorphonuclear neutrophil, PMN)的凋亡[1]. Ueda等[2]研究发现, IL-18在重症急性胰腺炎患者血清中明显增加, 并且与患者的严重程度呈明显的相关性. 虽然现有学者研究了IL-18在SAP中的相关作用, 但是, IL-18在延迟PMN凋亡方面的研究少有报道, 本研究建立SAP大鼠模型, 动态监测IL-18在血清的中表达, 并测定PMN凋亡情况, 探讨IL-18与SAP时PMN凋亡的关系.

1 材料和方法
1.1 材料

健康♂健康SD大鼠60只, 清洁级, 体质量250-300 g, 由上海交通大学附属第六人民医院实验动物中心提供; 牛黄胆酸钠(Sigma公司, 美国); 大鼠中性粒细胞分离液(LZS1091)(天津灏洋生物制品科技有限公司, 中国); 凋亡试剂盒(BD公司, 美国); 流式分析仪BD FACSCalibur(美国); 大鼠IL-18 ELASA试剂盒(RND公司, 美国).

1.2 方法

1.2.1 分组及造模: 健康SD大鼠60只随机分为2组: 急性坏死性胰腺炎(acute necrotizing pancreatitis, ANP)组和假手术组(SO组). ANP组30只, 假手术SO组30只, 每组在术后3 h、6 h、12 h下腔静脉抽血(各组各时间点10只), 随即处死大鼠, 取胰腺组织, 用100 g/L甲醛溶液固定. ANP组模型的制作参照Banerjee[3]方法加以改进制作大鼠重症胰腺炎模型: 各组动物术前12 h禁食, 可以自由饮水, 采用30 g/L戊巴比妥钠(1 mL/kg体质量)腹腔内注射麻醉; 麻醉成功后仰卧, 正中切口进入腹腔, 提起十二指肠, 在胰胆管开口十二指肠系膜缘对侧肠壁上, 用穿刺针(套管针内芯)穿入胰胆管约0.4 cm, 用无损伤的动脉夹临时阻断胰胆管的上下端后加压注射50 g/L牛黄胆酸钠(1 mL/kg体质量), 注射速度为0.2 mL/min, 注射完毕后5 min拔针, 检查无出血, 关腹; SO组仅开腹, 翻动胰腺, 再关腹. 每组大鼠麻醉苏醒后, 自由饮水、禁食.

1.2.2 血清淀粉酶的检测: 血清淀粉酶采用全自动生化分析仪(VITROS.950)检测.

1.2.3 中性粒细胞的分离: 采血后, 立即用梯度离心法进行PMN的分离, 加入PBS液悬浮细胞, 计数板计数, 调整细胞浓度至1×106/mL.

1.2.4 PMN活力检测: 取2滴细胞悬液加滴4%台盼蓝染色, 活细胞不着色, 死细胞染成蓝色, 计度200个细胞, 计算活细胞百分率, 拒染细胞数应>95%. PMN活力 = 拒染细胞数/200×100%.

1.2.5 中性粒细胞凋亡检测: 用4 ℃的PBS洗涤分离的中性粒细胞2次, 加Binding Buffer 60 mL, 加入Annexin V-FITC 5 mL, 摇匀后于室温避光孵育15 min, 上机前5 min在反应管中加入Propidium Iodide 5 mL, 然后再补加Binding Buffer 150 mL, 流式细胞仪检测中性粒细胞凋亡指数. Annexin V阳性为凋亡细胞, PI阳性为坏死细胞, Annexin V及PI双阴性为存活细胞.

1.2.6 血清中IL-18水平的测定: 采用酶联免疫吸附法, 试剂盒购自RND公司, 操作方法严格按照试剂盒说明书进行.

1.2.7 光镜下胰腺组织病理学改变: 常规石蜡包埋、切片、HE染色, 制作病理HE切片. 有资深病理科医师盲法对胰腺病理切片进行观察并按照Schmids法[4]的标准进行组织病理评分, 观察各组胰腺组织病变程度.

统计学处理 所有数据用mean±SD表示, 采用SPSS17.0统计软件分析处理; 组间计量资料采用配对t检验, 组内计量资料采用单因素方差分析; 两变量间关系采用直线相关分析; P<0.05表示差异有统计学意义.

2 结果
2.1 各组血清淀粉酶含量变化

ANP组血中的淀粉酶水平在模型建立成后逐渐升高, 并在12 h达峰值(9888.0±1498.06), 各时间点均较SO组高(P<0.05), 而SO组血清淀粉酶的含量较低(表1).

表1 各组血淀粉酶、胰腺组织病理评值变化 (n = 10, mean±SD).
分组时间(h)血淀粉酶(U/L)胰腺组织病理评分
ANP组32 577.00±890.22ac6.4±1.35ac
65 521.30±1 177.08ac8.3±1.34ac
129 888.0±1 498.06ac10.7±1.95ac
SO组3770.60±161.250.1±0.32
6788.10±192.010.2±0.42
12713.80±199.970.1±0.32
aP<0.05 vs SO组各时间点;
cP<0.05 vs ANP组间.
2.2 胰腺组织变化

肉眼观察: SO组胰腺无明显变化, 腹腔内未见异常; ANP组大鼠腹腔内可见血性腹水, 胰腺有坏死灶, 腹腔脏器粘连, 肠系膜、大网膜上有大量皂化斑. 光镜下: SO组大鼠的胰腺组织无明显变化; SAP组的大鼠胰腺组织可见胰腺腺泡水肿、组织坏死, 中性粒细胞、淋巴细胞等炎症细胞浸润以及出血坏死病灶形成, 且随着时间的延长病变逐渐加重(图1). ANP组各时间点的胰腺组织病理学评分均较SO组高(P<0.05, 表1).

图1
图1 各时间点胰腺组织HE染色病理情况(×100). A: SO组3 h; B: ANP组3 h; C: ANP组6 h; D: ANP组12 h.
2.3 各组大鼠不同时间外周血中性粒细胞凋亡率的变化

模型制成后, 随着时间推移, ANP组大鼠的凋亡率逐步下降, 12 h达到最低(2.15±0.45), 与SO组各个时间段(3、6、12 h)两两相比差异有统计学意义(P<0.01, 表2, 图2).

表2 各组大鼠PMN凋亡率及血清IL-18的变化 (n = 10, mean±SD).
分组PMN凋亡率(%)
血清IL-18(μg/L)
3 h6 h12 h3 h6 h12 h
ANP组4.51±0.69bd3.30±0.59bd2.15±0.45bd1 974.80±374.54bd3 585.10±466.26bd4 705.70±296.30bd
SO组6.56±0.626.67±0.766.37±1.01804.25±471.18845.07±514.30756.08±412.81
bP<0.01 vs SO组各时间点;
dP<0.01 vs ANP组间.
图2
图2 各组大鼠外周血PMN凋亡率的变化. A: SO组3 h; B: ANP组3 h; C: ANP组6 h; D: ANP组12 h.
2.4 各组大鼠不同时间血清中IL-18含量的变化

SO组的血清IL-18含量较低, 且各时间点无明显差别; 而ANP组大鼠的血清IL-18含量明显增高, 且随着时间的延长逐渐增加, 在12 h最高(4705.70±296.30), 各时间点两两相比较差异有统计学意义(P<0.01). ANP组与SO组相比, 差异有统计学意义(P<0.01, 表2, 图3).

图3
图3 各组大鼠血清IL-18浓度变化.
2.5 相关性

ANP组外周血PMN凋亡率与胰腺病理评分及血清IL-18浓度的变化均呈负相关, 相关系数分别为r = -0.602, -0.78(均P<0.01).

3 讨论

中性粒细胞是寿命很短的一种细胞, 正常衰老的PMN多以凋亡的方式死亡, 之后多被巨噬细胞识别、吞噬、清除; 凋亡时不发生细胞膜的破裂, 被吞噬细胞吞噬后不释放其毒性细胞内容物, 这对促进炎症的消散和局限发挥着重要的作用[5]. 而在一些炎症性疾病如SAP时, PMN的凋亡延迟, 中性粒细胞过度激活, 导致了其除了分泌细胞因子外, 还引起"呼吸爆发", 释放大量的自由基、蛋白水解酶及炎症介质等有害物质引起组织的损害, 产生级联反应, 诱发全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)的发生. 导致炎症性疾病的病情加重, 造成恶性循环, 从而引起SAP等炎症性疾病时SIRS甚至多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome MODS)的发生[6].

本实验发现, 在SAP时, 大鼠造模成功后的3 h、6 h、12 h, 外周血的PMN的凋亡率逐渐下降, 至12 h达到最低值(2.15±0.45), 而SO组大鼠的凋亡率维持在较高的水平, 且各个时间点ANP组均较SO组为低, 两两比较差异有统计学意义(P<0.01), 在ANP组不同的时间点两两比较亦有统计学意义(P<0.01). 这与李俊等[7]的研究相一致, 他们发现, 在ANP组大鼠循环中的PMN凋亡明显降低, 提示PMN的凋亡参与了急性胰腺炎的病理生理过程, 并对急性胰腺炎的严重程度和转归有很大的影响.

IL-18是IL-1细胞因子超家族的成员, 是一种新近发现的促炎症细胞因子, 与IL-1b相似, 主要由枯否细胞和活化的巨噬细胞产生, 他由不具有生物活性的母体蛋白合成, 需要被caspase-1裂解为具有活性的成熟蛋白[8]. 近年来, 有学者研究发现, IL-18可以通过调控促凋亡蛋白、抗凋亡蛋白、TNF-a以及激活NF-kB等作用机制来抑制PMN的凋亡[1,9,10]. 关于IL-18与急性胰腺炎的关系, 有学者研究发现血清IL-18的浓度与急性胰腺炎合并胰腺外脏器的损害存在着明显的相关性[11]. 也有学者报道, 在急性胰腺炎患者的血清中, IL-18的水平在病变早期就开始增加, 到病变后期, 患者出现胰腺坏死及全身并发症时都一直维持着较高的水平[12]. 虽然现在有众多学者研究了IL-18在SAP中的相关作用, 但是, 在IL-18在延迟SAP时中性粒细胞凋亡方面的研究少有报道.

本实验发现, 在造模成功后的3 h、6 h、12 h, ANP组大鼠血清中的IL-18的含量在逐渐升高, 在12 h时达到最高值(4705.70±296.30); 而SO组含量较低, ANP组内相比较差异有统计学意义(P<0.01), ANP组与SO组各时间点相比较, 差异有统计学意义(P<0.01); 且ANP组大鼠外周血的PMN的凋亡率与血清中的IL-18的含量呈明显的负相关(r = -0.78; P<0.01), 与胰腺病理评分亦呈负相关(r = -0.602, 均P<0.01). 说明IL-18可能参与了ANP大鼠外周血PMN的凋亡延迟作用.

根据我们的研究发现, SAP大鼠外周血PMN的凋亡呈现明显延迟, 同时, 血清IL-18的含量逐渐增加, 二者呈明显的负相关(r = -0.78; P<0.05), 说明IL-18可能参与了PMN的凋亡延迟作用, 但是具体机制仍未完全清楚, 需要进一步的研究.

总之, IL-18在全身炎症包括SAP时是一个有力的抑制中性粒细胞凋亡的介质, 能够成为一个新的治疗靶点, 进而阻止中性粒细胞相关的组织损害以及随后发生的SIRS以及MODS.

评论
背景资料

有学者提出SAP时炎症反应的消退依赖于PMN的凋亡, 而PMN的延迟凋亡是SAP患者发生SIRS并进展为MODS的重要环节. IL-18是一种新发现的促炎细胞因子, 近来发现其与PMN凋亡存在关系.

同行评议者

陈光, 教授, 吉林大学第一医院消化器官外科

研发前沿

当前研究认为IL-18与PMN的凋亡有关, 相关分子机制的研究中还有不少问题需要进一步阐明: 如IL-18在PMN凋亡延迟中涉及的信号转导通路及作用环节; IL-18在凋亡中所涉及的凋亡调控蛋白, 其与促、抗凋亡蛋白的关系等.

应用要点

本研究为进一步阐明PMN延迟凋亡在SAP发病过程中的作用, 探讨IL-18延迟PMN凋亡的具体作用机制以及研究SAP新的治疗靶点方面提供了科学的实验依据.

同行评价

本研究通过建立SAP大鼠模型, 动态监测IL-18在血清中的表达, 测定PMN凋亡情况, 证明IL-18可能在SAP外周血PMN凋亡中发挥作用. 本研究有新意, 可能对SAP的发病机制和治疗有新的认识.

编辑:张姗姗 电编:何基才

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