修回日期: 2012-05-11
接受日期: 2012-05-16
在线出版日期: 2012-05-28
目的: 观察羊栖菜多糖(sargassum fusiforme polysaccharides, SFPS)对内毒素(lipopolysccharide, LPS)诱导的肝星状细胞HSC-T6的增殖活化、氧化损伤及凋亡的影响, 并探讨其抗纤维化的机制.
方法: 将大鼠HSC-T6细胞株置DMEM培养液中, 37 ℃ 50 mL/L CO2条件下培养传代后分为空白对照组、LPS模型组、LPS+不同剂量SFPS组. 加药处理48 h后, MTT比色法检测细胞增殖; Annexin V-FITC标记法检测细胞的凋亡; 比色法检测MDA/SOD的含量; 采用ELISA法检测Ⅰ型胶原蛋白的表达; Western blot法检测α-SMA的表达.
结果: LPS能明显诱导HSC-T6的增殖、提高MDA的分泌及Ⅰ型胶原和α-SMA的表达、降低SOD的分泌; 与模型组相比, SFPS(25、50、100 mg/L)组可以不同程度抑制HSC-T6增殖并能诱导其凋亡、减少MDA分泌及Ⅰ型胶原和α-SMA的表达、增加SOD的分泌(均P<0.05).
结论: SFPS可能具有一定的抗纤维化作用, 其与诱导HSC-T6凋亡及保护LPS诱导的HSC-T6细胞氧化应激损伤有关.
引文著录: 张雪琴, 吴金明, 黄智銘, 吴建胜, 方红龙. 羊栖菜多糖对内毒素诱导的大鼠肝星状细胞增殖活化、氧化损伤及凋亡的影响. 世界华人消化杂志 2012; 20(15): 1333-1337
Revised: May 11, 2012
Accepted: May 16, 2012
Published online: May 28, 2012
AIM: To investigate the effect of sargassum fusiforme polysaccharides (SFPS) on the proliferation, activation, oxidative damage and apoptosis of lipopolysccharide (LPS)-induced rat hepatic stellate cells (HSCs), and to evaluate the anti-fibrotic mechanism of SFPS.
METHODS: Cultured rat HSCs were divided into five groups: control group, LPS group, and three LPS plus SFPS groups (treated with LPS plus low-, medium- or high-dose SFPS). After 48 h, cell proliferation was assessed by MTT colorimetric assay. Apoptotic cells were detected by annexin V-FITC/PI double labeling and flow cytometry. MDA/SOD contents were measured by colorimetry. The levels of type I collagen were measured by ELISA. Western blot were used to detect the expression of α-smooth muscle actin.
RESULTS: LPS induced proliferation, increased the secretion of MDA and the expression of typeⅠcollagen and α-smooth muscle actin, and reduced the secretion of SOD in HSCs (all P < 0.05). Compared to the LPS group, treatment with different doses of SFPS inhibited proliferation, induced apoptosis, reduced secretion of MDA, decreased the expression of typeⅠcollagen and α-SMA, and increased secretion of SOD (all P < 0.05).
CONCLUSION: These results suggest that SFPS can alleviate liver fibrosis by inducing apoptosis of HSCs and protecting against LPS-induced oxidative stress.
- Citation: Zhang XQ, Wu JM, Huang ZM, Wu JS, Fang HL. Effect of sargassum fusiforme polysaccharides on lipopolysaccharide-induced proliferation, activation, oxidative damage and apoptosis of rat hepatic stellate cells. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2012; 20(15): 1333-1337
- URL: https://www.wjgnet.com/1009-3079/full/v20/i15/1333.htm
- DOI: https://dx.doi.org/10.11569/wcjd.v20.i15.1333
肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSCs)的活化和增殖是肝纤维化形成过程中的关键环节[1]. 近来有研究表明, 内毒素与肝纤维化的发生发展有着密切的关系[2]. 在各种治疗肝纤维化的方法中, 诱导HSCs凋亡、保护受损的肝细胞成为目前的研究热点. 羊栖菜多糖(sargassum fusiforme polysaccharides, SFPS)提取自羊栖菜, 经研究发现有抗氧化、促进肿瘤细胞凋亡的作用, 但其机制尚不明确. 本研究主要观察SFPS体外能否诱导活化的HSCs凋亡及其抗氧化作用, 为中药治疗肝纤维化提供新的途径.
大鼠HSC-T6细胞株由本实验室保存. 羊栖菜(SFPS, 温州医学院陈晓明老师馈赠)、 DMEM(高糖型)培养液和胎牛血清(美国GIBCO公司)、内毒素(LPS, 美国SIGMA公司)、0.25%胰蛋白酶(美国GIBCO公司)、四甲基偶氮唑盐(MTT, 北京索来宝生物公司)、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(Biovision公司)、丙二醛测定试剂盒(MDA, 南京建成生物工程研究所)、超氧化物歧化酶测定试剂盒(SOD, 南京建成生物工程研究所)、小鼠抗大鼠α-肌动蛋白单克隆抗体及β-actin抗体(美国Santa Cruz公司)、山羊抗小鼠二抗(武汉博士得生物工程有限公司).
1.2.1 HSC-T6细胞的培养与传代: 细胞复苏后以5×105/瓶接种于25 cm2细胞培养瓶(Corning), 以完全培养基(DMEM高糖培养基+100 mL/L胎牛血清)在37 ℃、50 mL/L CO2培养箱培养, 隔天换液, 待细胞长至70%-80%密度时, 用0.25%胰蛋白酶进行消化, 按1:3比例传代.
1.2.2 分组: 本研究分为 空白对照组(A组)、LPS 1.0 μmol/L组(B组)、 1.0 μmol/L LPS+SFPS 25 mg/L组(C组)、1.0 μmol/L LPS+SFPS 50 mg/L组(D组)和1.0 μmol/L LPS+SFPS 100 mg/L组(E组).
1.2.3 MTT法检测细胞增殖活力: 取对数生长期细胞, 按1×104个/孔接种于96孔板, 每组4个复孔, 培养24 h后, 用无血清培养基同步化处理24 h, 按分组处理, 终止培养前4 h每孔加入10 μL MTT (5 g/L), 培养结束时小心吸除上清, 加100 μL DMSO/孔, 振荡10 min溶解结晶物, 酶标仪570 nm波长测各组吸光度(A)值. 以正常对照组A值为对照, 计算各组细胞存活率. 细胞存活率(%) = (各组A值/正常对照组A值)
1.2.4 Annexin V-FITC/PI标记法检测细胞凋亡: 收集各组细胞, 用4 ℃预冷的PBS洗涤2次. 500 μL结合缓冲液重悬细胞, 调节其浓度为3×l05, 加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI, 混匀后于室温避光孵育5 min, 流式细胞仪(Becton Dickinson, FACS Vantage SE)分析结果.
1.2.5 比色法检测MDA/SOD: 过氧化脂质降解产物中MDA可与硫代巴比妥酸(Thibabituric acid, TBA)缩合, 形成红色产物, 经过比色可测定MDA含量. 收集培养板上的细胞, 加入PBS液反复冻融后, 按试剂盒说明测定其中的MDA含量. 黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基, 后者氧化羟胺形成亚硝酸盐, 在显色剂的作用下呈现紫红色, 当被测样品中含SOD时, 则抑制超氧阴离子自由基使亚硝酸盐形成减少. 收集培养板上的细胞培养液, 采用黄嘌呤氧化酶比色法测定SOD活性.
1.2.6 ELISA法检测Ⅰ型胶原的表达: 收集做MTT时药物处理后的上清液. 按Ⅰ型胶原ELISA试剂盒操作说明书操作. 酶标仪450 nm波长处测A值, 绘出标准曲线, 根据样品(A)值在曲线图上查出相应Ⅰ型胶原含量.
1.2.7 Western blot法检测α-SMA(43 kDa)的表达: 加入各组蛋白样品经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转移至PVDF膜, 封闭1 h后, 加入α-肌动蛋白单克隆抗体抗体(1:400)和内参照GAPDH抗体(1:500), 一抗过夜后加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1:3 000)作用1 h, 电化学发光法检测, 在暗室中X光胶片曝光并冲洗显影, 用BioSens SC810软件测定各条带的灰度值, 经内参照β-actin校正后得到蛋白的相对表达量.
统计学处理 数据用mean±SD表示, 采用SPSS17.0作One-way ANOVA分析, 两两比较用LSD检验, P<0.05为差异有统计学意义.
各组细胞的存活率A组为73.1%±3.4%、B组为94.7%±2.3%、C组为89.1%±1.5%、D组为86.1%±2.7%、E组为78.7%±1.3%, 差异有统计学意义(P<0.05). LSD法两两比较, B组>C组>D组>E组>A组, 均有统计学意义(P<0.05). 与空白组相比, LPS对HSCs的增殖有明显的促进作用(P<0.01), 与模型组相比, SFPS对LPS诱导的HSCs的增殖具有明显的抑制作用, 且随着SFPS浓度的增加细胞增殖下降, 呈剂量依赖性(P<0.05, 图1).
HSC-T6细胞凋亡率A组为7.4%±1.4%、B组为5.6%±2.1%、C组为9.8%±2.0%、D组为12.7%±1.7%、E组为15.3±3.6%, 差异有统计学意义(P<0.05). 与模型组相比, SFPS能明显促进肝星状细胞的凋亡, 并呈剂量依赖性(P<0.05, 图2).
与模型组相比, SFPS(25、50、100 mg/L)组可以不同程度增加SOD的分泌及减少MDA分泌(均P<0.05, 表1).
Ⅰ型胶原的表达各组表达量A组为90.51±2.23, B组为256.63±3.43, C组为206.32±5.49, D组为184.35±9.62, E组为139.28±4.81, 差异有统计学意义(F = 19.06, P<0.05). LSD法两两比较, B组>C组>D组>E组>A组, 均有统计学意义(P<0.05). 与空白组对比, 内毒素能明显促进HSCs表达Ⅰ型胶原(P<0.01), 不同剂量SFPS作用后, 与模型组相比,Ⅰ型胶原表达受到抑制并呈剂量依赖性(P<0.05).
各组灰度比值A组为0.38±1.12, B组为0.87±2.05, C组为0.80±1.23, D组为0.73±0.84, E组为0.54 ±2.33, 差异有统计学意义(F = 76.24, P<0.01). LSD法两两比较, B组>C组>D组>E组>A组, 均有统计学意义(P<0.05). LPS能明显促进HSCs表达α-SMA(P<0.01), 与模型组相比, 不同剂量SFPS作用后, LPS诱导的肝星状细胞分泌的α-SMA表达受到抑制并呈剂量依赖性(P<0.05, 图3).
肝纤维化是慢性肝病的共同病理学基础, 是形成肝硬化的必经病理阶段[3]. 虽然肝纤维化的确切病因还未明确, 但是各种致病因素能造成肝细胞坏死, 激活库普弗细胞(Kupffer cell, KC), 分泌炎性因子, 如TNF-α、TGF-β、血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor, PDGF)、白介素-1(interleukin-1, IL-1), 最终共同使静息HSCs激活、转化为肌成纤维细胞(myofibroblast, MFB)[4,5]. HSCs是位于Disse间隙的一种间质细胞, 正常情况下处于静息状态, 活化后表达α-SMA水平升高, 合成包括胶原在内的细胞外基质. 大量资料表明: HSCs的增殖和活化是肝纤维化发生的细胞学基础, 是各种病因致肝纤维化发生的共同中心环节[6]. 表达α-SMA是HSCs特异性的活化标志[7]. 氧化应激在HSCs活化、增殖中亦起重要作用[8]. 损伤的肝细胞、活化的KC以及嗜中性粒细胞等炎症细胞均可以产生H2O2等活性氧(ROS), 这些ROS及其脂质过氧化物(LPO)降解产物, 可以通过旁分泌机制刺激HSCs活化, 进而分泌ECM增多促进肝纤维化的发生.
近年研究表明, 内毒素与肝纤维化的发生发展有着密切关系. 肝损伤状态下, 肝脏对内毒素排除作用减弱, 造成其在体内大量堆积, 而促进肝纤维化的发展. 以往多以TNF-α、PDGF和TGF-β1刺激HSCs建立体外肝纤维化模型, 因为PDGF是HSCs最强大的趋化因子和促分裂原, 引起HSCs增殖, 但是胶原增加不明显, TGF-β1具有强大的促HSCs分泌胶原作用, 但是细胞增殖受抑制. LPS是革兰氏阴性细菌细胞壁的主要成分, 也称脂多糖, 是众多促进HSCs活化刺激物之一. 本实验通过适当浓度的刺激, 发现HSCs在一定范围内增殖较明显, 较高浓度时损伤占主导地位. Gandhi等[9]研究发现, LPS可上调在HSCs活化中具有重要意义的ET-1受体, 是通过NO依赖和非NO依赖机制实现的. 另外一定浓度的内毒素直接作用与HSCs能使其TGF-β1表达增加, 这可能是内毒素促进肝纤维化的途径之一, PDTC是NF-KB抑制剂, 作用于HSCs可使TGF-β1表达降低[10]. 还有LPS价格较便宜, 比较经济, 这为以后构建体外肝纤维化模型提供了一个新的途径.
MDA是脂质过氧化产物, 他的水平间接反映了机体细胞受自由基攻击的严重程度, 而SOD的活力又间接反映机体清除自由基的能力, 他们是一对互相影响的指标.
临床研究发现肝纤维化在一定情况下可通过减少活化的HSCs来逆转, 可以通过以下方法实现: (1)活化HSCs转变为静止状态; (2)活化HSCs发生凋亡[6]. HSCs活化后其表型很难逆转, 而通过促进活化的HSCs凋亡可能是治疗肝纤维化的不错的选择. 本实验通过LPS刺激HSC-T6建立了体外肝纤维化模型, SFPS可以抑制活化的HSCs增殖并促进其凋亡, 使其活化标志物α-SMA表达减少, 降低Ⅰ型胶原的分泌, 降低HSCs培养液中异常升高MDA的含量, 同时提高SOD的活力而起到抗肝纤维化的作用[11].
羊栖菜在我国沿海广泛分布, 多年来的研究表明羊栖菜多糖具有抗肿瘤、降血脂血糖及修复细胞氧化损伤等活性. 如: SFPS诱导HL-60细胞凋亡, 其机制可能与fas/fasl表达增多有关[12]; SFPS对H2O2所致人脐静脉内皮细胞损伤有保护及修复作用[13]; SFPS可对抗H2O2诱导的胰岛β细胞凋亡[14,15]. 且该药具有取材方便, 价格低廉, 如果能用于预防或治疗肝纤维化将有重要的意义.
肝星状细胞 (HSCs)的活化和增殖是肝纤维化形成的关键环节. 近来有研究表明, 内毒素与肝纤维化的发生发展有着密切的关系.各种治疗肝纤维化的方法中, 以诱导HSCs凋亡、保护受损的肝细胞成为目前的研究热点, 羊栖菜多糖(SFPS)经研有抗氧化、促进肿瘤细胞凋亡作用, 但其机制尚不明确.
倪润洲, 教授, 江苏省南通市, 南通大学附属医院消化内科; 田字彬, 教授, 山东省青岛市, 青岛大学医学院附属医院
羊栖菜在我国沿海广泛分布, 多年来的研究表明羊栖菜多糖具有抗肿瘤、降血脂血糖及修复细胞氧化损伤等活性.
本文利用提取的海洋多糖体外刺激活化的肝星状细胞, 结果可以促进活化细胞凋亡, 胶原分泌减少等多方面说明可能用于肝纤维化的治疗.
SFPS可诱导活化的HSCs凋亡及抗氧化作用, 为中药治疗肝纤维化提供新的途径.
本研究设计尚合理, 有一定的科学意义和潜在的应用价值, 为中药治疗肝纤维化提供新的途径.
编辑:张姗姗 电编:闫晋利
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