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世界华人消化杂志. 2012-05-18; 20(14): 1238-1241
在线出版日期: 2012-05-18. doi: 10.11569/wcjd.v20.i14.1238
TGF-β1和Smad2在胃癌中的表达及意义
沈卫东, 刘鹏飞, 刘兵团, 项斌, 张伟
沈卫东, 刘鹏飞, 刘兵团, 项斌, 张伟, 东南大学医学院附属江阴医院消化内科 江苏省江阴市 214400
沈卫东, 主治医师, 主要从事消化系疾病的基础与临床研究.
作者贡献分布: 此课题由沈卫东设计; 研究过程由刘兵团、沈卫东、项斌及张伟操作完成; 研究所用新试剂及分析工具由刘兵团提供; 数据分析由刘鹏飞、刘兵团及沈卫东完成; 本论文写作由沈卫东完成.
通讯作者: 沈卫东, 主治医师, 214400, 江苏省江阴市寿山路163号, 东南大学医学院附属江阴医院消化内科. shenwd2003@yahoo.com.cn
电话: 0510-86879453 传真: 0510-86871307
收稿日期: 2011-10-20
修回日期: 2012-03-19
接受日期: 2012-04-19
在线出版日期: 2012-05-18

目的: 检测TGF-β1和Smad2信号在胃癌中的表达, 探讨TGF-β1和Smad2在胃癌发生、发展中的作用.

方法: 采用免疫蛋白印迹(Western blot)和实时定量PCR检测45例胃癌组织及相应正常组织TGF-β1、Smad2蛋白及mRNA的表达, 比较正常对照、癌组织中上述二者表达的差异, 并进行统计学分析.

结果: TGF-β1在胃癌组织中阳性表达率为77.8%(35/45), 在正常组织中为33.3%(15/45), 二者比较差异显著(P<0.05); Smd2蛋白在胃癌组织中阳性表达率为73.3%(33/45), 在正常组织中为26.7%(12/45), 二者比较有显著差异(P<0.05); TGF-β1、Smad2 mRNA在胃组织中阳性表达率分别为88.9%(40/45)、84.4%(38/45), 均显著高于正常组织(P<0.05). 胃癌组织中TGF-β1、Smad2蛋白的表达与病理分级、浸润深度、淋巴结转移、脉管侵犯相关(P<0.05).

结论: TGF-β1和Smad2可能在胃癌的发生、发展中发挥作用, 并与胃癌的侵袭、转移相关.

关键词: 转化生长因子-β1; 细胞信号转导分子-2; 胃癌
引文著录: 沈卫东, 刘鹏飞, 刘兵团, 项斌, 张伟. TGF-β1和Smad2在胃癌中的表达及意义. 世界华人消化杂志 2012; 20(14): 1238-1241
Expression of TGF-β1 and Smad2 in human gastric cancer
Wei-Dong Shen, Peng-Fei Liu, Bing-Tuan Liu, Bin Xiang, Wei Zhang
Wei-Dong Shen, Peng-Fei Liu, Bing-Tuan Liu, Bin Xiang, Wei Zhang, Department of Gastroenterology, Affiliated Jiangyin Hospital of Southeast University, Jiangyin 214400, Jiangsu Province, China
Correspondence to: Wei-Dong Shen, Attending Physician, Department of Gastroenterology, Affiliated Jiangyin Hospital of Southeast University, 163 Shoushan Road, Jiangyin 214400, Jiangsu Province, China. shenwd2003@yahoo.com.cn
Received: October 20, 2011
Revised: March 19, 2012
Accepted: April 19, 2012
Published online: May 18, 2012

AIM: To investigate the correlation of the expression of transforming growth factor-β1 (TGF-β1) and mothers against decapentaplegic homolog 2 (Smad2) with the carcinogenesis and tumor progression of human gastric cancer.

METHODS: Western blot and real-time PCR were used to detect the expression of TGF-β1 and Smad2 protein and mRNA in 45 cases of gastric cancer and matched normal gastric mucosal tissues.

RESULTS: The positive rates of TGF-β1 and Smad2 protein expression were significantly higher in gastric cancer than in normal gastric mucosa (77.8% vs 33.3%, 73.3% vs 26.7%, both P < 0.05). The positive rates of TGF-β1 and Smad2 mRNA expression were also significantly higher in gastric cancer than in normal tissue (88.9% vs 35.6%, 84.4% vs 31.1%, both P < 0.05). The protein expression of TGF-β1 and Smad2 was correlated with pathological grade, lesion depth, lymph node metastasis and vessel invasion.

CONCLUSION: Overexpression of TGF-β1 and Smad2 may play an important role in the development and progression of gastric cancer.

Key Words: Transforming growth factor-β1; Mothers against decapentaplegic homolog 2; Gastric cancer
0 引言

Smad蛋白家族是转化生长因子β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)超家族细胞内信号转导过程中极其重要的介导分子, 主要介导TGF-β1的生物学信号通路. Smad蛋白家族分为3个不同的亚族: 受体调节型Smad蛋白(R-Smads, 包括Smad2和Smad3)、共调节型Smad蛋白(Co-Smads, 包括Smad4)和抑制性蛋白(I-Smads, 包括Smad6和Smad7). Smad2、3磷酸化与Smad4形成异聚复合体, 将信号从胞浆转移到细胞核中, 与其他转录协同因子和抑制因子共同调节下游靶基因的转录[1]. TGF-β1/Smad通路参与胚胎发育、间质纤维化、肿瘤发生发展和炎症修复反应等诸多生物学过程, 有研究表明, 该通路的异常激活与横纹肌肉瘤、结肠癌等发生有关, 但在胃癌中的表达情况尚未见相关报道[2]. 因此, 探讨TGF-β1和Smad2在胃癌组织中的表达, 有助于阐明其病理生理机制, 并为临床上寻找新的治疗靶标提供坚实的理论依据.

1 材料和方法
1.1 材料

45例胃癌组织及相应的正常组织取自东南大学医学院附属江阴医院2011-01/06期间行手术切除的胃癌患者, 其中男31例, 女14例, 年龄32-77岁(平均62.5岁±10.3岁). 肿瘤组织取自肿块中心未发生坏死的组织, 正常组织取自距肿块5 cm以外区域, 病理检测未见癌细胞浸润, 所有患者术前均未行放、化疗, 所有癌组织标本术后均经病理学专家确诊为胃癌.

根据1997年国际抗癌联盟TNM分期标准将45例胃癌分为Ⅰ/Ⅱ期17例, Ⅲ/Ⅳ期33例. 肿瘤浸润深度: T1/T2期22例, T3/T4期28例(T1: 肿瘤浸润至黏膜或黏膜下层; T2: 肿瘤浸润至肌层或浆膜层; T3: 肿瘤已穿透浆膜层, 但未侵及邻近组织; T4: 肿瘤侵及邻近组织或器官). 按术后病理分为高/中分化10例, 低分化35例. 34例患者手术病理证实存在淋巴结转移, 占60%, 9例有脉管侵犯.

1.2 方法

1.2.1 蛋白质印迹法检测TGF-β1/Smad蛋白表达: 将组织匀浆后提取蛋白, BCA法测定总蛋白含量, 取各组总蛋白, 加入5×上样缓冲液6 μL/管. 加去离子水调整每组上样体积为30 μL, 恒压80 V(浓缩胶)、120 V(分离胶). 8%分离胶行SDS-PAGE 80 min, 恒流200 mA, 冰上转膜3 h, 5%脱脂奶粉封闭l h, 分别加入单抗(稀释度1:750)和β-actin单抗(稀释度l:3 000), 室温混悬仪转动2-3 h, 4 ℃孵育过夜; TBST漂洗20 min×3次, 加入二抗(稀释度1:1 000), 室温混悬仪转动2 h, TBST漂洗20 min×3次. ECL显影, 暗室胶片曝光, 洗片. 凝胶定量软件Quantity One分析各条带灰度值, 以β-actin为内参照计算各组蛋白相对表达量.

1.2.2 Real-time PCR检测TGF-β1/Smad2基因表达: TRIzol法提取组织总RNA, 并逆转录为cDNA, 并配制反应体系, 将反应液加入384-Well Clear Optical Reaction Plate内, 每列16个孔均加入同一基因、不同样品的反应体系. 每个反应均设重复孔; 将加完样的384-Well Clear Optical Reaction Plate置入7900HT荧光定量PCR仪中, 按如下的反应条件进行PCR扩增和荧光定量(扩增条件: 95 ℃ 1 min; 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 60 s, 40个循环; 60 ℃ 15 s, 最后95 ℃ 15 s). 荧光定量数据分析采用参照基因的△Ct法计算每个样本目的基因的表达值, 其中△Ct值表示基因反应产物的荧光值达到设定的域值时的反应循环数.

统计学处理 应用SPSS16.0进行统计分析, P<0.05具有统计学差异. 计量资料用mean±SD表示, 计数资料用整数表示.

2 结果
2.1 TGF-β1/Smad2蛋白在胃癌组织、正常组织中的表达及比较

45例胃癌组织中检出TGF-β1蛋白35例(阳性率77.8%), 正常组织中检出15例(阳性率33.3%); 检出Smad2蛋白33例(阳性率为73.3%), 正常组织中检出12例(阳性率为26.7%). 胃癌组织TGF-β1、Smad2蛋白阳性率显著高于正常组织(P = 0.000), 且与正常组织相比, TGF-β1、Smad2在胃癌组织样品中的表达强度分别提高3.9倍(P<0.01)、3.3倍(P<0.01, 图1, 2).

图1
图1 TGF-β1蛋白表达. aP<0.05 vs 正常组织.
图2
图2 Smad2蛋白表达. aP<0.05 vs 正常组织.
2.2 Real-time PCR测定TGF-β1、Smad2、3基因在组织中的转录水平

TGF-β1 mRNA在45例胃癌组织中测出40例(88.9%), 正常组织中测出16例(35.6%); 45例胃癌组织中Smad2 mRNA测出38例(84.4%), 正常组织中测出14例(31.1%). 与正常组织相比, 胃癌组织TGF-β1、Smad2 mRNA阳性率显著高于正常组织(P = 0.000), TGF-β1、Smad2、Smad3在胃癌组织样品中的表达强度分别提高3.5倍(P<0.01)、2.6倍(P<0.05).

2.3 胃癌组织中TGF-β1/Smad2蛋白的表达及与临床病理参数的关系

TGF-β1、Smad2表达与肿瘤病理分级、淋巴结转移、浸润深度、脉管浸润有相关性, 与其他临床病理特征性别、年龄、肿瘤大小无明显关系无明显统计学意义(表1, 2).

表1 胃癌组织中TGF-β1的蛋白表达 (n = 45).
临床特征TGF-β1蛋白表达
P值
(n = 35)阳性(n = 10)阴性
年龄
<601340.5741
≥60226
性别
男2560.1762
女104
肿瘤大小
<4 cm1240.4071
≥4 cm236
病理分级
高/中分化280.0002
低分化332
浸润深度
T1/T2680.0001
T3/T4292
淋巴结转移
(+)3120.0431
(-)48
脉管浸润
(+)3150.0011
(-)45
1χ2检验;
2Fisher确切概率法.
表2 胃癌组织中Smad2的蛋白表达 (n = 45).
临床特征Smad2蛋白表达
P值
(n = 33)阳性(n = 12)阴性
年龄
<601230.6982
≥60217
性别
男2380.4391
女104
肿瘤大小
<4 cm1150.2242
≥4 cm227
病理分级
高/中分化280.0002
低分化314
浸润深度
T1/T2590.0002
T3/T4283
淋巴结转移
(+)3030.0112
(-)39
脉管浸润
(+)3150.0002
(-)27
1χ2检验;
2Fisher确切概率法.
3 讨论

TGF-β超家族由一类结构、功能相关的多肽生长因子亚家族组成, 其中包括TGF-β1、生长分化因子(growth differentiation factor, GDF)、骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)、活化素(activin)等. TGF-β除了对细胞的增殖、分化产生影响, 还在胚胎发育、胞外基质形成、骨的形成和重建等方面起着重要作用[3,4]. TGF-β1超家族成员通过与2种不同型(I型、Ⅱ型)受体结合而发挥作用, 其中I型为丝氨酸(Ser)激酶型受体, Ⅱ型为苏氨酸(Thr)激酶型受体, 而细胞内信号传导的特异性由I型受体决定. TGF-β1参与多种细胞生长调控机制, 在细胞的表型转化中起到极为重要的作用, 并且与恶性肿瘤的生物学行为及预后密切相关. TGF-β1在肿瘤发展过程中可以刺激血管生成、抑制免疫反应、促进细胞外基质(extracellular matrix, ECM)形成, 为肿瘤细胞的快速生长、转移提供良好的局部环境, 成为促进肿瘤发展的因子[5-8].

本组实验中, 胃癌组织中TGF-β1蛋白表达的阳性率为77.8%, mRNA表达的阳性率为88.9%, 均明显高于正常对照组(P<0.05); 正常组织中即使有TGF-β1蛋白表达, 其表达强度亦显著低于癌组织, 提示检测胃癌组织中TGF-β1的表达对于预测肿瘤的恶性程度有一定价值, 也进一步说明TGF-β1可能在肿瘤的发生发展进程及细胞恶性表型转化过程中起重要作用.

Smad蛋白是由Smad基因编码的相对分子质量为42-60 kDa的蛋白质分子, 是TGF-β1受体复合物的下游信号调节蛋白, 存在于胞质中, 可将信号由胞膜传导至胞核调节转录[9,10]. 有研究表明, TGF-β1/Smad2信号途径参与了模纹肌肉瘤、肝癌、结肠癌等的发生发展, 但在胃癌中的表达情况尚未见报道. 研究表明, Smad2与TGF-β1早期诱导基因mRNA对辨别正常及肿瘤组织具有良好敏感性和特异性, 说明Smad2在肿瘤增殖中起重要作用, 且对鉴别正常及肿瘤组织有一定的价值[11-13].

本组研究结果表明, 胃癌组织中Smad2蛋白阳性率为73.3%, 显著高于正常组织(P<0.05). Smad2 mRNA阳性表达水平为84.4%, 正常组织为31.1%, 正常组织中即使有Smad蛋白、mRNA表达, 其表达强度亦显著低于胃癌组织. 提示Smad基因表达的变化参与了胃细胞癌变, 在胃癌的发生、发展中起到了一定作用.

另外, 本研究还发现, 癌旁组织TGF-β1/Smad2蛋白、mRNA均存在差异表达, 即mRNA的表达明显高于蛋白表达, 这种差异表达的真实生物学意义尚不清楚, 或许提示在胃癌形成过程中Smad2基因密码突变而不表达蛋白, 也可能存在某种物质调节或抑制了TGF-β1及Smad2蛋白的翻译, 这些变化直接或间接地参与了胃癌形成过程.

同时我们也研究了TGF-β1、Smad2与胃癌临床病理特征之间的关系, 发现二者的表达均与肿瘤病理分级、淋巴结转移、浸润深度、脉管浸润有相关性, 已发生淋巴结转移或浸润已达到浆膜层的组织、有脉浸润的组织TGF-β1、Smad2表达高(P<0.05), 表明其表达可能与胃癌的浸润、转移有一定相关性. 本研究未发现TGF-β1、Smad2与患者年龄、性别、肿瘤大小等临床病理特征之间有明显相关性. 我们通过对胃癌组织中TGF-β1/Smad2的联合检测, 发现他们是浸润、转移情况的一项重要指标, 具有一定的临床应用前景. 但目前对TGF-β1/Smad2信号通路作用于肿瘤的确切机制尚不完全清楚, 需要进一步深入研究[14,15].

评论
背景资料

研究表明, TGF-β1/Smad通路的异常激活与横纹肌肉瘤、结肠癌等发生有关, 但在胃癌中的表达情况尚未见相关报道. 探讨TGF-β1和Smad2在胃癌组织中的表达, 有助于阐明其病理生理机制, 并为临床上寻找新的治疗靶标提供坚实的理论依据.

同行评议者

傅春彬, 主任医师, 吉化集团公司总医院一院消化内科; 高泽立, 副教授, 上海交大医学院九院周浦分院消化科

应用要点

TGF-β1、Smad2与患者年龄、性别、肿瘤大小等临床病理特征之间有明显相关性. 通过对胃癌组织中TGF-β1/Smad2的联合检测, 发现他们是浸润、转移情况的一项重要指标, 具有一定的临床应用前景.

同行评价

通过检测TGF-β1和Smad2信号在胃癌中的表达, 探讨TGF-β1和Smad2在胃癌的发生、发展中的作用, 对胃癌发生机制的研究提供了一些线索, 具有一定的研究意义.

编辑:张姗姗 电编:闫晋利

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