临床研究 Open Access
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世界华人消化杂志. 2012-04-28; 20(12): 1018-1024
在线出版日期: 2012-04-28. doi: 10.11569/wcjd.v20.i12.1018
Lumican蛋白在胰腺导管腺癌间质中的表达及其与Ki-67、VEGF及突变型P53表达的相关性
袁菲, 周尘飞, 金晓龙
袁菲, 金晓龙, 上海交通大学医学院附属瑞金医院病理科 上海市 200025
周尘飞, 上海交通大学医学院附属瑞金医院外科 上海消化外科研究所 上海市 200025
袁菲, 副主任医师, 主要从事病理研究.
基金项目: 上海市卫生局科研基金资助项目, No. 2009047.
作者贡献分布: 本课题由袁菲设计; 研究过程、统计分析及文章书写由袁菲与周尘飞完成; 金晓龙指导与审校.
通讯作者: 金晓龙, 教授, 200025, 上海市瑞金二路197号, 上海交通大学医学院附属瑞金医院病理科. xlj6@hotmail.com
电话: 021-64370045-662235 传真: 021-64373909
收稿日期: 2011-11-07
修回日期: 2012-01-29
接受日期: 2012-03-25
在线出版日期: 2012-04-28

目的: 观察细胞外基质蛋白Lumican在胰腺导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma, PDA)中表达特征, 分析Lumican与Ki-67、VEGF、突变型P53等肿瘤恶性表型相关分子的关联.

方法: 采用免疫组织化学染色(IHC)和逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测PDA原发灶及对应癌旁胰腺组织中Lumican表达. IHC检测PDA原发灶Ki-67、VEGF及突变型P53表达. 用SPSS软件行统计学分析.

结果: PDA原发灶中, Lumican表达在mRNA及蛋白质水平均明显高于癌旁胰腺组织. 就该蛋白在癌灶中的分布特性而言, Lumican蛋白主要定位于癌间质, 阳性表达率为83.0%(83/100). 低分化PDA中, 癌间质过表达Lumican与TNM分期相关(χ2 = 6.446, P<0.05), 与年龄、性别、淋巴结转移、远处转移等无明显相关. 高中分化PDA中, 癌间质过表达Lumican与临床病理特征无关, 而与Ki-67(r = -0.28, P = 0.017)、VEGF(r = -0.264, P = 0.025)及突变型P53(r = -0.253, P = 0.032)表达呈明显负相关.

结论: Lumican在PDA原发灶中表达高于癌旁胰腺组织, 主要分布于癌间质. Lumican在癌间质过表达与低分化PDA的TNM分期相关, 与高、中分化PDA的Ki-67、VEGF及突变型P53表达呈负相关.

关键词: 胰腺导管腺癌; Lumican; 肿瘤微环境
引文著录: 袁菲, 周尘飞, 金晓龙. Lumican蛋白在胰腺导管腺癌间质中的表达及其与Ki-67、VEGF及突变型P53表达的相关性. 世界华人消化杂志 2012; 20(12): 1018-1024
Lumican protein expression in pancreatic ductal adenocarcinoma: clinical significance and correlation with expression of Ki-67, VEGF and mutated P53
Fei Yuan, Chen-Fei Zhou, Xiao-Long Jin
Fei Yuan, Xiao-Long Jin, Department of Pathology, Ruijin Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200025, China
Chen-Fei Zhou, Department of Surgery, Ruijin Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiaotong University; Shanghai Institute of Digestive Surgery, Shanghai 200025, China
Supported by: the Research Foundation of Shanghai Municipal Health Bureau, No. 2009047.
Correspondence to: Xiao-Long Jin, Professor, Department of Pathology, Ruijin Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200025, China. xlj6@hotmail.com
Received: November 7, 2011
Revised: January 29, 2012
Accepted: March 25, 2012
Published online: April 28, 2012

AIM: To detect the expression of Lumican in pancreatic ductal adenocarcinoma and to analyze its correlation with expression of Ki-67, VEGF and mutated P53.

METHODS: One hundred surgically resected cancer samples collected from patients with pathologically confirmed pancreatic ductal adenocarcinoma and 15 tumor-adjacent pancreatic tissue samples were used in the study. Lumican expression in these tissue samples was detected by immunohistochemistry (IHC) and reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). Expression of Ki-67, VEGF and mutated P53 was detected by IHC.

RESULTS: The expression levels of Lumican mRNA and protein in cancer tissue were significantly higher than those in tumor-adjacent tissue. The positive rate of Lumican expression in tumor stroma was 83.0% (83/100). In poorly differentiated samples, stromal expression of Lumican was significantly correlated with TNM stage (χ2 = 6.446, P < 0.05), but not with age, gender, lymph node metastasis or distant metastasis. In well differentiated samples, stromal expression of Lumican had a significant negative correlation with expression of Ki-67 (r = -0.28, P = 0.017), VEGF (r = -0.264, P = 0.025) and mutated P53 (r = -0.253, P = 0.032), but had no correlation with pathological characteristics of pancreatic ductal adenocarcinoma.

CONCLUSION: Lumican expression is higher in pancreatic ductal adenocarcinoma than in tumor-adjacent tissue and correlates with TNM stage in poor differentiated samples. There is a negative correlation between expression of Lumican and that of Ki-67, VEGF and mutated P53 mutation in well differentiated samples.

Key Words: Pancreatic ductal adenocarcinoma; Lumican; Microenvironment
0 引言

胰腺癌发病率及死亡率均居我国恶性肿瘤前列[1], 起病隐匿, 恶性程度高, 总体5年生存率不超过5%[2], 其中90%左右为胰腺导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma, PDA)[3]. PDA的发生、发展受众多因素调控, 肿瘤基质微环境异常是其中重要因素之一[4]. 富亮氨酸小分子蛋白聚糖(small leucine-rich proteoglycan, SLRP)家族是细胞外基质的主要组成部分, 其成员包括decorin、biglycan、Lumican等[5,6], 研究显示decorin能抑制肿瘤细胞增殖及迁移[7]. Lumican亦被发现在包括胰腺癌、乳腺癌、结直肠癌及肺癌等肿瘤中呈异常表达[8-11], 可能影响肿瘤生物学行为, 但其确切生物学功能尚存争议. Lumican与胰腺癌细胞增殖、血管生成等恶性生物学行为的关系鲜见报道. 本研究通过构建组织芯片, 观察PDA间质中Lumican的表达特征, 分析其与临床病理特征的关系, 并研究Lumican与Ki-67、VEGF及突变型P53表达的相关性[12], 以初步探明Lumican与PDA癌细胞恶性表型的关系, 为后续研究积累基础.

1 材料和方法
1.1 材料

收集上海交通大学医学院附属瑞金医院2002-2007年手术切除的100例PDA癌组织标本, 40 g/L甲醛溶液固定, 石蜡包埋. 其中15例同时留取癌旁非肿瘤胰腺组织, 离体后即刻取部分成对组织于液氮冻存. 所有病例均有完整的临床病理资料. TNM分期按美国癌症联合会(AJCC)第6版胰腺癌分期标准进行[13].

1.2 方法

1.2.1 组织芯片构建: 采用组织芯片(tissue microarray, TMA)制作仪, 穿取100例PDA癌组织, 制成组织微阵列蜡块, 4 μm连续切片, 40 ℃贴片(载玻片经0.1%多聚赖氨酸防脱片处理), 56 ℃烤片3 h后至37 ℃恒温箱中过夜, 常温蜡封后保存备用.

1.2.2 免疫组织化学染色(immunohistochemistry, IHC): 切片经脱蜡至水, 微波煮沸修复抗原, 3%H2O2封闭内源性过氧化酶, 磷酸盐缓冲液洗涤后, 正常血清封闭20 min. 分别滴加一抗, Lumican(购自R&D Systems公司, 工作浓度1∶100); Ki-67、VEGF、P53(购自DAKO公司, 工作浓度1∶50), 4 ℃孵育过夜. PBS洗涤后, 生物素二抗室温孵育10 min. PBS洗涤后, 链霉素-生物素-过氧化物酶室温孵育10 min. DAB显色, 光镜下观察及时终止显色反应. 苏木素复染细胞核, 常规分化、脱水、透明、封片. IHC标记结果判定: Lumican蛋白定位于组织间质, VEGF定位于细胞质, Ki-67及P53定位于细胞核. Lumican、VEGF、P53阳性强度评价: 阳性细胞数<5%为-; <25%为+; <50%为++; ≥50%为+++. Lumican表达评价: -为阴性表达; + - ++为阳性表达; +++为强阳性表达[8]. Ki-67选取阳性细胞相对密集的10个高倍视野计算阳性细胞百分数.

1.2.3 逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)检测Lumican基因表达: 将液氮中冻存的15例新鲜癌组织和癌旁非肿瘤胰腺组织匀浆, 抽提总RNA, 逆转录cDNA后行PCR扩增(以β-actin为内参). Lumican引物序列, 正义链: 5'-CCACAACAA CCTGACAGAGT-3'; 反义链: 5'-CAAGTTGATTGACCTCCAGG-3', 产物469 bp. 反应体系为: 10×buffer 2.5 μL, Mg2+ 2.5 μL, dNTP 0.5 μL, Lumican上下游引物各1 μL(5 μmoL/L), Taq酶 0.1 μL, ddH2O 16.4 μL, cDNA 1 μL; 反应条件: 95 ℃预变性5 min; 95 ℃变性30 s, 60 ℃退火30 s, 72 ℃延伸30 s, 共36次循环; 最后72 ℃延伸10 min, 4 ℃保存. 取PCR扩增产物5 μL, 行凝胶电泳检测. 用Sysgene软件定量分析, 检测并计算Lumican与β-actin表达的吸光度比值.

统计学处理 采用χ2检验分析等级资料, 配对t检验分析吸光度(A)比值, Spearman相关性检验分析表达相关性. 所有检验均采用双侧P<0.05为有统计学意义. 统计分析使用SPSS13.0统计软件进行.

2 结果
2.1 Lumican在PDA癌组织中表达水平

Lumican在PDA癌组织中表达水平高于癌旁胰腺组织, 主要分布于癌间质. 将取自15对组织的PCR产物进行凝胶电泳分析显示, Lumican mRNA相对表达量在癌组织中明显高于癌旁胰腺组织(A值1.22±0.07 vs 1.05±0.06, P<0.001, 图1). IHC显示, Lumican蛋白主要定位在组织间质中, 并在癌间质中呈高表达, 阳性率为83.0%(83/100), 在癌旁胰腺组织间质中呈低表达(图2).

图1
图1 PCR产物进行凝胶电泳分析显示Lumican在胰腺导管腺癌间质中的过表达.
图2
图2 Lumican在胰腺导管腺癌间质中过表达(免疫组织化学染色×200). A: 癌旁非肿瘤胰腺组织间质; B: 高中分化癌间质; C: 低分化癌间质.
2.2 低分化PDA中Lumican过表达与肿瘤TNM分期相关

100例PDA患者中, 男性60例, 女性40例; 中位年龄59岁(31-79岁); 根据AJCC 肿瘤TNM分期, Ⅰ-Ⅱ期患者83例, Ⅲ-Ⅳ期患者17例; 高中分化腺癌72例, 低分化腺癌28例. Lumican在低分化PDA癌间质中表达率为78.6%(22/28), 高中分化癌间质表达率为84.7%(61/72), 两者无明显差异(P>0.05). 低分化癌间质中Lumican蛋白表达与肿瘤TNM分期相关; Ⅲ-Ⅳ期PDA中, Lumican癌间质表达水平明显高于Ⅰ-Ⅱ期(6/6比16/22, χ2 = 6.446, P = 0.031). 而与患者年龄、性别、淋巴结转移、远处转移等临床病理特征无关. 在高中分化癌中, Lumican癌间质表达与患者临床病理特征无明显相关性(表1).

表1 Lumican在不同分化胰腺导管腺癌间质中表达与临床病理特征关系.
临床病理因素高中分化(n = 72)
χ2值P值低分化(n = 28)
χ2值P值
阴性阳性强阳性阴性阳性强阳性
年龄
<6053040.7170.6991923.8040.143
≥6062525110
性别
男73040.5610.75541410.7851.000
女4252261
T分期
T2-394961.0660.65461606.4460.031
T4260042
淋巴结转移
N074040.4220.90541202.5470.318
N14152282
远处转移
M0115260.4881.00061921.5861.000
M1030010
TNM分期
I-II94660.8060.72861606.4460.031
III-IV290042
神经/脉管侵犯
无32111.4230.4913204.5200.077
有83453182
2.3 高中分化PDA中Lumican过表达与Ki-67、VEGF及突变型P53表达呈负相关

癌组织Ki-67、VEGF及突变型P53阳性表达率在高中分化PDA分别为54.2%、80.6%及94.4%, 在低分化PDA为78.6%、82.1%及96.4%. 低分化癌Ki-67表达阳性率明显高于高中分化癌(P = 0.025), 而VEGF及突变型P53表达无明显差异(P = 0.456, P = 0.804). 相关性分析显示, 高中分化腺癌中, Lumican癌间质表达强度与Ki-67(r = -0.28, P = 0.017)、VEGF(r = -0.264, P = 0.025)及突变型P53(r = -0.253, P = 0.032)表达均呈负相关, 而在低分化腺癌中未显示明显相关性(表2, 图3).

表2 肿瘤间质中Lumican与Ki-67、VEGF及P53表达水平相关性分析.
检测项目高中分化(n = 72)
低分化(n = 28)
n%r值P值n%r值P值
Ki-67
<5%3345.8-0.2800.017621.40.1400.478
≥5%3954.22278.6
VEGF
-1419.4-0.2640.025517.90.1800.359
+811.127.1
++2129.2517.9
+++2940.31657.1
P53
-45.6-0.2530.03213.60.0910.645
+1013.8621.4
++1825.0725.0
+++4055.61450.0
图3
图3 高中分化癌中Lumican、Ki-67、VEGF及突变型P53表达情况(DAB显色, ×200). 在高中分化PDA中, Lumican蛋白表达与Ki-67、VEGF及突变型P53表达呈负相关. A, B: 高中分化癌组织HE染色; C, E, G, I: 低表达; D, F, H, J: 高表达.
3 讨论

本研究结果显示, Lumican蛋白在PDA癌间质中过表达, 并且在不同分化程度肿瘤的间质中表达特征存在差异. 在低分化腺癌中, Lumican癌间质过表达与肿瘤不良分期相关, 而在高中分化腺癌中, 则与肿瘤细胞增殖、血管生成等恶性表型相关因素Ki-67、VEGF及突变型P53表达水平呈负相关.

Lumican为分泌型蛋白, 属SLRP家族Ⅱ型成员之一, 定位于染色体12q21.3-q22区, 其核心蛋白分子量为37 kDa, 连接硫酸角质素或聚乙酰氨基乳糖侧链, 可形成相应的蛋白聚糖及糖蛋白结构[5]. Lumican在角膜组织、皮肤、肺、肾、脑等多脏器细胞外间质中广泛表达, 其基因同源缺失可导致小鼠眼角膜混浊及皮肤松弛[14]. 胰腺癌中, 肿瘤细胞及间质星形细胞均可表达Lumican蛋白[8,15,16]. 本研究亦显示, Lumican在PDA癌间质中过表达, 且明显高于癌旁非肿瘤胰腺组织.

由于Lumican蛋白直接参与细胞外间质的构成, 分析其在组织间质中的表达特征能够较准确地反映Lumican蛋白潜在生物学活性. 本研究结果显示, 低分化PDA癌间质中Lumican蛋白过表达与肿瘤较大及较晚的TNM分期相关. 提示Lumican癌间质的异常表达可能促进了低分化癌的恶性表型. Ishiwata等[8]亦发现胰腺癌间质中Lumican过表达与肿瘤不良分期、后腹膜及十二指肠侵犯等因素相关. 在肺鳞状细胞癌中, Lumican在肿瘤间质的过表达则与肿瘤血管侵犯相关[11].

Ki-67、VEGF过表达及突变型P53均为胰腺癌患者预后不良相关因素[17,18], 本研究显示, 在高中分化PDA中, Lumican蛋白间质表达与Ki-67、VEGF过表达及突变型P53呈负相关. 既往文献显示了Lumican作为肿瘤抑制相关基因的潜在可能, 体外研究发现, Lumican基因同源缺失小鼠胚胎成纤维细胞增殖能力增强而凋亡减少[19]; 纤维肉瘤细胞在含Lumican蛋白的培养基中增殖能力下降, 抑癌相关基因p21表达增加[20]; 小鼠胰腺癌细胞中过表达Lumican蛋白可抑制其体内成瘤能力, 并减少肿瘤血管生成[21]. Lumican还可抑制内皮细胞增殖、脉管形成及侵袭能力[22]. 结合文献及本研究结果, 提示Lumican蛋白在高中分化PDA癌间质中的过表达亦可能参与抑制了肿瘤细胞增殖及血管生成等. 在低分化PDA中, Lumican表达与Ki-67、VEGF过表达及P53突变相关性虽无统计学意义, 但相关系数(r)均为正值, 结合其与肿瘤不良分期的相关性, 提示Lumican与低分化PDA恶性生物学行为的潜在联系. 综上所述, Lumican蛋白在不同分化程度PDA癌间质中潜在生物学行为可能不同. 在对不同分化程度的人骨肉瘤细胞研究中发现, 敲低Lumican在细胞内表达后, 高分化Saos2细胞增殖能力增强, 而中分化MG-63增殖能力无明显改变[23].

造成Lumican蛋白功能差异的原因可能与其本身特征相关, Lumican侧链基团修饰是影响其生物学功能的重要因素之一, 其糖蛋白及蛋白聚糖形式在肿瘤研究中均有报道. 胰腺癌细胞株分泌低硫酸角质素修饰的Lumican糖蛋白[16], 黑色素瘤细胞株WM9及M5则表达硫酸角质素修饰的Lumican蛋白聚糖[24]. 转染外源性Lumican基因至小鼠B16F1黑色素瘤细胞中使Lumican糖蛋白分泌增加, 并抑制B16F1细胞的体内成瘤能力[25]. 然而, Lumican糖蛋白在角膜胚胎发育及促角膜上皮损伤后修复中起重要作用[5,14]. 显示了Lumican蛋白侧链修饰的组织特异性及功能差异, 本研究中, 不同分化程度的PDA肿瘤间质中Lumican蛋白是否存在侧链修饰的差异, 进而影响其生物学功能尚待明确.

此外, SLRP家族蛋白通过结合细胞膜受体, 调控细胞内信号, 影响正常细胞增殖、分化、细胞黏附及迁徙等生物学行为. 在胰腺癌中, Lumican受体及其相关下游信号通路尚未明确. 细胞外Lumican蛋白结合至黑色素瘤细胞膜α2β1整联蛋白后, 可抑制肿瘤细胞迁移[26]. 而在胰腺癌中, α2β1整联蛋白与细胞外基质成分Ⅰ型胶原蛋白相作用后, 则促进了细胞增殖及侵袭[27].

本研究结果提示, Lumican蛋白在PDA中异常表达, 且不同分化的肿瘤、癌间质中Lumican表达特征不同. 因此, Lumican在PDA中的生物学功能尚待阐明, 明确其侧链修饰特异性及功能相关信号通路改变, 将有助于揭示其在不同分化PDA中差异表达机制及功能.

评论
背景资料

胰腺癌恶性程度高, 预后不佳. 肿瘤基质微环境在其发生发展中起重要作用. Lumican蛋白是细胞外间质成分之一, 属富亮氨酸小分子蛋白聚糖家族. Lumican蛋白在肿瘤中表达特征及生物学功能研究结论尚存分歧.

同行评议者

谷俊朝, 主任医师, 首都医科大学附属北京友谊医院普外科

研发前沿

Lumican蛋白在不同分化程度的胰腺导管腺癌中表达特征不同, 其具体生物学功能亟待明确.

相关报道

Lu等发现, Lumican蛋白定位于胰岛α细胞及胰腺组织间质, 胰腺癌细胞表达聚乙酰氨基乳糖侧链修饰的Lumican糖蛋白. Ishiwata等发现, 胰腺癌间质Lumican阳性表达与女性患者、不良分期、后腹膜及十二指肠侵犯等临床病理因素相关.

创新盘点

除临床病理特征外, 本文进一步研究了在不同分化程度胰腺导管腺癌中, Lumican蛋白与肿瘤Ki-67、VEGF及突变型P53表达相关性.

应用要点

通过对胰腺导管腺癌中Lumican蛋白与肿瘤增殖、血管生成等相关因素分析, 为进一步生物学功能研究的提供线索.

同行评价

本研究内容较新, 并对其在高中分化和低分化胰腺癌组织中的表达特征进行分析, 论述思路清晰, 语言较流畅.

编辑: 曹丽鸥 电编: 闫晋利

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