修回日期: 2011-12-23
接受日期: 2012-03-20
在线出版日期: 2012-04-18
随着对肿瘤认识的不断深入, 人们发现在原发肿瘤形成和生长的早期阶段, 肿瘤细胞即可以脱离原发肿瘤组织释放到外周血形成循环肿瘤细胞, 同样在肿瘤形成的早期阶段就会出现肿瘤细胞的坏死和凋亡, 这些凋亡或坏死的肿瘤细胞也可以释放其DNA入外周血形成血浆或血清游离的DNA, 因此对肿瘤患者循环肿瘤细胞及游离DNA的分析被认为是实时的"液相活检", 肿瘤患者中的循环肿瘤细胞具有非常强的异质性, 我们可以根据其物理和生物学性质采用不同的技术对其进行富集和检测; 可以借助现代分子生物学手段对循环游离DNA进行提取, 并对其遗传学和表观遗传学的异常改变进行分析, 这可为肿瘤的早期诊断、疗效评估、复发监测及预后判断提供重要的信息. 本文结合本课题组的研究重点, 就循环肿瘤细胞及游离DNA及其甲基化在肝细胞癌患者的研究进行综述.
引文著录: 邱必军, 薛峰, 余坚, 夏强. 循环肿瘤细胞及游离DNA甲基化在肝细胞癌患者中的研究进展. 世界华人消化杂志 2012; 20(11): 946-952
Revised: December 23, 2011
Accepted: March 20, 2012
Published online: April 18, 2012
During the early formation and growth of a primary tumor, tumor cells can be detached from the primary tumor and circulate through the bloodstream to form circulating tumor cells (CTCs). Also during the early stage of tumor development, apoptotic and necrotic tumor cells can release DNA into the bloodstream to form circulating cell-free DNA. Therefore, analysis of CTCs and circulating cell-free DNA is considered as a real-time "liquid biopsy" for cancer patients. CTCs are very heterogeneous and can be enriched and detected using different technologies based on their physical and biological properties. The use of modern molecular biological techniques to extract the cell-free DNA in circulating blood and detect aberrant genetic and epigenetic alterations can provide valuable information for the early diagnosis, prediction of response to therapy, recurrence monitoring and prognosis evaluation in cancer patients. In this paper, we will give a review of recent advances in understanding the clinical significance of CTCs and cell-free DNA in patients with hepatocellular carcinoma.
- Citation: Qiu BJ, Xue F, Yu J, Xia Q. Advances in understanding clinical significance of circulating tumor cells and cell-free DNA methylation in patients with hepatocellular carcinoma. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2012; 20(11): 946-952
- URL: https://www.wjgnet.com/1009-3079/full/v20/i11/946.htm
- DOI: https://dx.doi.org/10.11569/wcjd.v20.i11.946
肝细胞癌(hepatocelluar carcinoma, HCC)是人类最常见的恶性肿瘤之一, 在肿瘤相关性死亡的病因中位列第3位[1]. 尽管在过去的10年里, HCC的治疗手段不断进步, 但其长期预后并未得到明显改善, 这其中最重要的原因是HCC往往无法得到早期诊断. 实际上, 很多患者在诊断为HCC时就已经出现疾病的局部进展或远处转移. 研究表明在肿瘤形成的早期阶段, 即可释放肿瘤细胞和肿瘤DNA至外周血, 形成循环肿瘤细胞及游离DNA[2,3], 这为我们对HCC的早期诊断、疗效判断及预后估计带来了新的载体.
早在1869年, Ashworth[4]在对一个转移性癌症的男性患者尸检时发现其外周血中存在和原发肿瘤组织相似的细胞, 他是一类脱离原发肿瘤组织进入外周血循环的肿瘤细胞, 这种脱离原发肿瘤组织的循环肿瘤细胞(circulating tumor cell, CTC)可以转移至远处其他组织器官形成转移灶, 转移灶中的肿瘤细胞也可以脱离肿瘤组织入血再次形成CTC, 这是CTC的主要来源, 往往这两种方式来源的CTC具有一定的异质性[5,6].
肿瘤在发生发展中常伴有肿瘤细胞的不断坏死和凋亡, 坏死或凋亡的肿瘤细胞会释放其DNA入血形成循环游离肿瘤DNA, 同样地, CTC及转移灶中的肿瘤细胞也会因为坏死和凋亡向外周血释放DNA, 形成循环游离肿瘤细胞DNA. 肿瘤患者中循环肿瘤细胞DNA只是循环游离DNA的一部分, 其他非肿瘤细胞在坏死和凋亡时也可以向外周血释放DNA形成游离DNA[5]. 研究发现肿瘤患者循环中游离DNA的水平通常要高于健康个体, 说明肿瘤患者中循环肿瘤细胞DNA是循环游离DNA的主要来源. 最近, Diehl等[7]估算对于一个肿瘤负荷为100 g(= 3×1010个癌细胞)患者来说, 每天将近有3.3%的肿瘤细胞DNA进入血循环. 这些DNA经过低浓度的琼脂糖凝胶电泳分析表明其片段大小在70-200 bp的小片段到近21 kb的大片段之间[8], 循环游离DNA的代谢机制至今尚未完全阐明, 目前认为肝脏、肾脏、血浆中的核酸酶在游离DNA的代谢清除中均发挥了重要的作用. 对分娩后母体血液循环中游离的胎儿DNA清除规律的研究表明, 游离DNA的消除半衰期仅为16.5 min[9], 循环中游离DNA的清除过程是迅速而又有效的[10,11].
通常情况下, 肿瘤患者中循环游离DNA的遗传学和表观遗传学异常改变是等同于原发肿瘤组织的, 这种异常改变包括点突变、DNA片段的高甲基化、微卫星序列的不稳定性以及杂合性的缺失. 然而, 血液循环游离DNA的异常改变并不总是和原发肿瘤一致[12], 这种差异至少可以部分归因于肿瘤患者中CTC及微小转移灶也可向外周血释放DNA所致.
近年来, 研究表明DNA序列以外的改变即表观遗传学改变在肿瘤的发生发展中发挥了重要作用, DNA甲基化修饰作为表观遗传学最重要的内容一直是人们研究的热点. 和非癌对照相比, 人类原发性肝细胞癌组织和已有的肝癌细胞系发现了多个基因的异常甲基化修饰, 特别是抑癌基因启动子区域的高甲基化引起的抑癌基因失活是肝癌发生发展的一个频繁的表观遗传学事件[13,14]. 在肿瘤患者中, 随着肿瘤细胞的凋亡和坏死伴有大量的DNA进入外周血形成循环游离DNA, 我们时常在肿瘤患者循环游离DNA中找到和原发肿瘤一致的遗传学及表观遗传学(包括DNA甲基化)改变[5], 健康个体的血浆游离DNA的浓度在0-100 μg/L之间, 平均值为30 μg/L. 肿瘤患者的血浆或血清中游离DNA的浓度波动在0到1 000 μg/L, 平均值为180 μg/L. 尽管肿瘤患者血液中游离DNA浓度要高于健康对照组, 但是两组中血浆或血清内全部游离DNA浓度变化区间均很大[15,16]. 在健康个体及良性和恶性疾病中, 血浆游离DNA浓度存在重叠现象, 因此仅对游离DNA浓度的定量分析似乎还不足以来进行良恶性疾病的诊断, 往往需要结合DNA的定性分析来进行诊断. 对于无局部进展及远处转移的部分肿瘤患者来说, 手术切除肿瘤后, 血浆游离DNA 的水平会降至健康个体的水平[17]. 然而, 如果手术后血浆游离DNA仍然保持较高的水平, 往往意味着肿瘤细胞的残留[18]. 过去的10多年里, 人们进行了大量关于循环游离DNA的水平及其甲基化在肝细胞癌的诊断、疗效判断及预后估计的研究.
2006年, 由Ren等[19]进行一项关于血清游离DNA水平和肝细胞癌患者长期预后的研究发现79例HCC患者血浆循环DNA浓度为47.1 μg/L±43.7 μg/L, 显著高于健康对照组(17.6 μg/L±9.5 μg/L), 但与肝硬化组(30.0 μg/L±13.3 μg/L)相比差异无统计学意义, 并且血清游离DNA水平和肿瘤大小及TNM分期密切相关, 和患者3年的无病生存率及整体生存率呈负相关. 同年, 由Iizuka等[20]的研究发现HCV相关性HCC患者血清游离DNA水平(141.1 μg/L±161.2 μg/L)较HCV携带者(34.4 μg/L±26.6 μg/L)或健康对照组(45.7 μg/L±22.6 μg/L)显著增高. 游离DNA在分化良好、中等分化及分化不良的肝细胞癌患者血清中的水平分别为90.5 μg/L±102.5 μg/L, 125.8 μg/L±80.4 μg/L及376.6 μg/L±408.5 μg/L. HCC患者中血清游离DNA水平和肿瘤的分化程度及大小相关, 和患者的年龄、性别、肿瘤的TNM分期及甲胎蛋白水平或凝血酶原前体蛋白水平没有明显相关性.
2007年, 上述研究小组[21]在一项回顾性对立研究中进一步证实了HCV相关性HCC患者血清中游离DNA的水平(115.9 μg/L±98.3 μg/L)要显著高于HCV携带者(34.4 μg/L±40.4 μg/L), 并且血清游离DNA水平高的HCC患者的总体生存期较血清游离DNA水平低的患者显著缩短. 血清游离DNA水平高的HCC患者术后更加容易发生肿瘤的远处转移. 相比之下, HCC患者术前血清游离DNA的水平和术后患者的无病生存期无明显相关性. 2011年, 由Huang等[22]通过对HCC患者、肝硬化患者及健康个体的血浆循环DNA的定量分析来评价其在HCC中的诊断及判断预后作用, 研究表明HCC患者血浆中循环DNA的水平(中位数: 173 μg/L)显著高于健康对照组(9 μg/L)及良性肝病对照组(46 μg/L), 此外, 还发现HCC患者血浆中循环DNA水平和肿瘤大小呈正相关的, 对于伴有肝内播散或血管侵犯的HCC患者血浆中循环DNA水平也显著升高.
2008年, Chan等[23]通过对HCC患者血清中游离DNA甲基化的定量分析发现: 高甲基化的RASSF1A基因片段在HCC、HBV携带者及健康对照个体中的检测率分别为93%、58%及8%. HCC患者和HBV携带者血清RASSF1A浓度的中位数分别为7.70×105 copies/L, 1.18×105 copies/L, 在刚诊断为HCC或肿瘤切除后1年时血清中RASSF1A浓度较高的患者无病生存率较低. 此外, 通过对HBV携带者的长期随访发现, 最终发展为HCC的HBV携带者循环中的RASSF1A浓度在诊断为HCC时显著增高.
2010年, Tsutsui等[24]进行了一项关于循环血液中甲基化的CCNDD2基因水平和HCV相关性HCC预后的研究, 在70例接受根治性肝切除的HCV相关性HCC患者中, 血清甲基化的CCND2基因为阳性(超过70 ng/L)共39例, 血清中甲基化的CCND2基因为阴性(不超过70 ng/L)的患者共31例, 与血清甲基化的CCND2阴性的患者相比阳性患者的无病生存期显著缩短, 血清甲基化的CCND2基因为阴性的患者中没有出现HCC早期肝内复发现象. COX多元统计分析发现血清中甲基化的CCND2基因水平是患者无病生存期的一个独立危险因素.
上述研究结果表明无论是何种原因引起的HCC患者, 其循环中游离DNA水平较良性肝病及病毒携带者或健康个体均明显升高, 游离DNA的水平和肿瘤分化程度及肿瘤大小密切相关, 往往游离DNA水平较高的患者远期预后较差.
p16基因又称之为CDKN2A, p16Ink4A基因, 是1994年美国冷泉实验室由Nobori等[25]发现的一种新的抑癌基因, 直接参与细胞周期的调控, 负调节细胞增殖及分裂. 目前认为p16是比p53更重要的一种新型抗癌基因, 有人把他比作细胞周期中的刹车装置, 一旦失灵则会导致细胞恶性增殖, 导致恶性肿瘤发生. 2011年由Zang等[26]进行的一项关于p16基因高甲基化在HCC及肝硬化中研究的荟萃分析, 研究表明p16基因高甲基化引起的p16基因失活在HCC形成中发生了重要的作用, 并与HCC及肝硬化的风险增大密切相关. 至今已有数项关于血浆或血清中p16基因甲基化和HCC的研究. 1999年, Wong等[27]首次在16例p16基因启动子区域甲基化阳性的HCC患者中, 检测到13例血清/血浆中存在p16基因的启动子区域甲基化, 而10名健康志愿者、38例慢性肝炎/肝硬化患者外周血中未检测到该区段DNA甲基化. 2000年, Wong等[28]将检测p16基因的启动子区域甲基化状态用于评价HCC治疗的疗效, 他们在49例HCC患者血浆中, 发现术后p16基因启动子区域甲基化水平中位数比术前降低12倍, 提示这种监测方法可以用来观察肝细胞癌疗效. 另外, Wong等[29]的研究还发现, 在HCC组织中, 分化良好、中等和不良3型的p16启动子甲基化率分别为67%、73%和75%; 临床分期T1、T2、T3和T4期患者甲基化率分别为40%、68%、69%和100%, 提示p16启动子甲基化水平与临床分期和病理分类有关; 而在T1、T2、T3和T4期p16启动子甲基化阳性患者中, 其血浆/血清p16甲基化阳性率分别为100%(2/2), 71%(12/17), 89%(8/9)和100%(2/2). 2004年, 韩国学者Chu等[30]对46例HCC及23例肝硬化患者血清中异常甲基化的p16INK4A基因进行检测, 研究发现HCC和肝硬化患者甲基化的p16INK4A基因检测率分别为47.8%(22/46), 17.4%(4/23). 2006年, Zhang等[31]通过对40份HCC组织及对应的39份血浆样本的甲基化p16基因进行检测, 研究发现组织和血浆中甲基化的p16基因检测率分别为62%(22/40)和32%(12/39), 血清中检测到甲基化p16基因的患者其对应的肝癌组织样本中也均出现了p16基因的甲基化. 2010年, Ahmed等[32]通过对HCV相关性的17例慢性活动性肝炎, 20例肝硬化及25例HCC患者血清中甲基化的p16INK4A基因研究发现, 血清中甲基化的p16INK4A基因在HCV相关性慢性活动性肝炎、肝硬化及HCC患者中的检测率分别为47.1%、5%和92%, 并且血清p16INK4A基因的甲基化和甲胎蛋白水平没有明显相关性.
2000年, Wong等[29]首次在25例HCC患者的肝癌组织中检测到16例存在p15基因启动子区域的异常甲基化, 在这16例p15基因启动子区域异常甲基化的HCC患者中有4例(25%)的血清/血浆中检测到了和肿瘤甲基化状态一致的表观遗传学改变. 在其余的9例未出现p15基因启动子区域异常甲基化的肝细胞癌或55例健康个体及无HCC的慢性肝炎或肝硬化患者的血清/血浆中均未能检测到甲基化的p15基因序列.
2006年, Wang等[33]研究发现26例肝癌组织中有23例检测到GSTP1基因启动子高甲基化, 并首次报道了在这23例患者的血清中有14例检测到了GSTP1基因的异常甲基化, 而在肝癌组织中未检测到GSTP1基因启动子高甲基化, HCC患者及健康个体的血清中均未检测到甲基化的GSTP1基因序列. 2007年, Zhang等[34]报道在诊断为HCC的50例患者中, 有35例(70%)可以在外周血中检测到RASSF1A启动子高甲基化.
最近由费伯健等[35]的一项关于血浆Ras相关区域家族蛋白1A基因甲基化在HCC分子诊断中价值的研究, 他们发现HCC患者血浆RASSF1A甲基化阳性率(47/72, 65.3%)显著高于健康对照(1/41, 2.4%)和肝良性病变组(3/37, 8.1%).
肝切除手术被认为是HCC患者根治性的手段, 然而大约40%的患者会在术后早期即1年内复发[36], 这么高的早期复发率被认为和肝切除术前已经存在的CTC相关. 这些CTC可以定值在远处器官产生转移灶也可以再次返回并定植到剩余的肝组织(self-seeding)产生肝内复发[37]. 近年来, 关于肝癌肝移植术后肿瘤复发机制的研究渐成热点, HCC患者在进接受肝移植手术治疗后, 不仅切除了肝肿瘤, 也去除了可能存在硬化的肝脏, 为什么术后还会出现肿瘤的复发和转移呢, 不难理解, 这种肿瘤复发要么是隐性转移灶(occult metastasis)的生长要么是CTC的定植所致. CTC在HCC患者行肝切除或肝移植治疗后肿瘤复发转移中似乎扮演了重要的角色[38].
基于CTC物理及生物学特性的CTC检测技术发展迅速, 目前基于EpCAM抗体磁珠的Cell Search系统是唯一被美国FDA批准用于检测乳腺癌、结肠癌、前列腺癌CTCs的装置. 过去的数年里已有大量关于CTC在乳腺癌、前列腺癌及大肠癌中的研究, 研究表明CTC在肿瘤的复发转移、疗效监测及预后估计上具有重要的临床意义, 甚至已被引进最新的乳腺癌TNM分期标准[39-42]. 尽管肝癌细胞也属于上皮细胞, 但HCC组织标本表达上皮细胞表面粘附分子(EpCAM)的比例很少[43], 因此Cell Search系统并不适用于HCC患者的CTC的富集和检测. 正是由于HCC患者CTC检测技术上的原因, 目前关于HCC患者CTC的研究报道较少.
最近由香港玛丽医院Fan等[44]进行的一项关于循环肿瘤干细胞(cancer stem cells, CSC)对HCC患者接受肝切除治疗后肿瘤复发预测的前瞻性研究, 他们利用流式细胞等技术对82例HCC患者循环CSC进行检测, 有56例(68.3%)检测到了循环CSC, 循环CSC的水平和肿瘤的大小及临床TNM分期显著相关, 与肿瘤的数目、微血管侵犯、分化程度或切除肿瘤组织中CSC所占的百分比没有明显相关性. 在有复发和无复发的HCC患者中循环CSC的中位水平分别为0.02%和0.01%(0.05%代表1 mL血液中存在5个CSC), 差异有统计学意义. 循环CSC水平超过0.01%对预测所有复发、肝内复发、肝外复发的准确度分别为73.2%、65.0%及73.2%. 通过单变量分析发现对肿瘤复发有显著影响的因素再次进行多参数分析表明, 循环CSC水平超过0.01%已成为肝癌术后肿瘤肝内复发及远处复发的最强预测因子.
最近由中国人民解放军第二军医大学附属东方肝胆医院Xu等[45]的一项基于去唾液酸糖蛋白受体的循环肝癌细胞分离/检测系统及其临床应用研究, 他们以生物素化去唾液酸胎球蛋白作为配体与肝癌细胞结合, 然后用抗生物素抗体磁珠进行间接磁性标记, 从而磁性捕获循环肝癌细胞, 接着用人肝细胞特异性Hep Par 1抗体进行免疫荧光染色鉴定, 并对阳性细胞进行计数. 由于肝细胞通常不会脱落进入血循环, 除非演变成肿瘤细胞, 因此检测到的细胞即为循环肝癌细胞. 该系统解决了以前所报道方法的固有问题, 具有高度的特异性和敏感性.
通过利用该系统对HCC患者、良性肝病患者和健康志愿者临床样本的检测, 探讨了该系统临床应用的可行性, 在受检的235例HCC患者外周血中, 195例可检出CTCs, 检出数为21个±25个, 阳性率为83%. 统计分析表明CTCs的阳性率和CTCs数目与门静脉癌栓、肿瘤大小、TNM分期、Milan标准符合情况具有显著相关性, 但与年龄、性别、病毒感染状况、Child-Pugh分级和血清AFP浓度均无相关性. 分析结果表明, CTCs阳性率从TNM分期的StageⅠ的67%至Stage Ⅳ的100%, 与TNM分期成正相关; CTCs检出数从StageⅠ的34个±5个至Stage Ⅳ的71个±34个, 与TNM分期也成正相关. 符合Milan标准的HCC患者CTCs阳性率为69%, 不符合Milan标准的HCC患者CTCs阳性率为91%, 符合Milan标准的HCC患者CTCs检出数为64个±8个, 不符合Milan标准的HCC患者CTCs检出数为294个±27个, 差异有统计学意义. CTCs阳性率与肿瘤大小成正相关, CTCs检出数与肿瘤大小也成正相关. 伴门静脉癌栓的HCC患者CTCs阳性率为93%, 不伴门静脉癌栓的HCC患者CTCs阳性率为69%; 伴门静脉癌栓的HCC患者CTCs检出数为324±28个, 不伴门静脉癌栓的HCC患者CTCs检出数为5±9个, 以上差异均具有统计学意义.
我们基于良恶性疾病循环游离DNA及其甲基化模式的不同的研究来发展肿瘤的标志物[46]. 通过对HCC患者循环游离DNA及甲基化的分析, 为HCC的早期诊断、疗效判断、复发监测及预后估计带来了很多有价值的信息, 发展了一种微创的肿癌标志物, 但仍有许多机制尚不完全明了, 循环游离DNA到底从何而来, 在血液中如何代谢? 在一些良性肝病中循环游离DNA浓度也会升高, 用循环游离DNA浓度作为HCC筛查的指标缺乏特异性, 需要结合对游离DNA的遗传学及表观遗传学分析(包括DNA甲基化)来提高其特异性, HCC患者循环中游离DNA不仅含有肿瘤基因组, 也含有正常细胞基因组. 无论是正常细胞还是肿瘤细胞, 其DNA片段进入血液循环具有随机性及不确定性. 这些都可能给基因分析带来干扰, 造成假阴性[47]. CTC在HCC患者肝切除或肝移植后肿瘤复发的机制上有着重要的地位. 但关于其在HCC患者中的研究报道还很少, 我们通过对HCC患者CTC的研究不但可以对肝癌的早期诊断、疗效判断、预后估计带来重要信息, 而且可能为改善肝癌患者在肝切除或肝移植后的长期预后找到新的靶点. CTC本身也是循环游离DNA的来源之一, 希望通过联合CTC及游离DNA的分析可以提高HCC的早期诊断率, 并为HCC患者接受根治性治疗(肝切除或肝移植)后的疗效评估及预后判断带来新的标准.
近年来随着对肿瘤认识的不断深入, 研究发现在肝细胞癌发生发展的早期阶段即有肿瘤细胞及其DNA释放入血, 基于循环肿瘤细胞及游离DNA表观遗传学改变的研究有望为肝细胞癌的早期诊断, 治疗效果的评价及随访复发带来新的有价值的信息和生物标志物.
倪润洲, 教授, 南通大学附属医院消化内科
尽管肝细胞癌患者循环游离DNA的遗传学改变和表观遗传学改变往往等同于原发肿瘤组织, 然而循环游离DNA到底从何而来, 在血液中如何代谢的机制还有待阐明.
Xu等以生物素化去唾液酸胎球蛋白作为配体与肝癌细胞结合, 然后用抗生物素抗体磁珠进行间接磁性标记, 从而磁性捕获循环肝癌细胞, 该系统解决了以前所报道方法的固有问题, 具有高度的特异性和敏感性.
本文分别就循环肿瘤细胞和游离DNA及其甲基化在肝细胞肝癌患者诊断、治疗效果评价、复发监测、预后判断中的作用进行综述, 并对循环肿瘤细胞和循环游离DNA之间的潜在的联系进行了描述, 两者相互结合的研究将在肝细胞癌患者的早期诊断、疗效果评价、复发监测、预后判断中发挥更大的作用.
目前, 关于肝细胞癌生物标志物的研究已由蛋白向核酸转变, 循环肿瘤细胞对于肝细胞癌的诊断具有极高的特异性, 对肝细胞肝癌患者术后复发具有重要的预测价值, 基于循环肿瘤细胞及游离DNA甲基化的研究将为肝细胞癌的早期诊断、疗效果评价、复发监测、预后判断提供重要的信息.
本文对肝细胞癌患者循环肿瘤细胞及游离DNA甲基化的研究进展进行了较全面的综述, 文章有较好的可读性, 能够使读者熟悉该领域的研究概况.
编辑: 张姗姗 电编: 鲁亚静
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