修回日期: 2011-12-19
接受日期: 2012-03-15
在线出版日期: 2012-04-08
目的: 观察全反式维甲酸(ATRA)联合奥沙利铂(L-OHP)对人SMMC-7721肝癌细胞增殖及凋亡的影响.
方法: 选用ATRA(10-5 mol/L)及不同浓度的L-OHP(10 mg/L、20 mg/L、40 mg/L), 并选用10-5 mol/L的 ATRA分别联合L-OHP(10 mg/L、20 mg/L、40 mg/L)作用于SMMC-7721肝癌细胞24 h、48 h、72 h; 采用MTT比色法观察其对SMMC-7721肝癌细胞的生长抑制作用, 倒置显微镜下观察细胞形态变化; 采用流式细胞术分析药物作用48 h时SMMC-7721细胞的周期分布和凋亡的情况.
结果: ATRA及不同浓度L-OHP单药及联合均可显著抑制SMMC-7721肝癌细胞的生长, 细胞形态改变, 凋亡比例增加, 并呈剂量-时间依赖性; 两药联合较单药相比作用明显增强(P<0.01); ATRA联合20 mg/L L-OHP与ATRA联合40 mg/L L-OHP相比, 作用细胞48 h及72 h时, 对细胞生长抑制作用无统计学差异; 两药联合较单药相比, 细胞凋亡率明显增加, 细胞阻滞S期增强(P<0.01).
结论: ATRA可抑制肝癌SMMC-7721细胞的生长并诱导细胞凋亡, 与L-OHP联用后作用增强并可减少奥沙利铂用量, 具有协同作用.
引文著录: 张海鹏, 杨家梅, 张嵩, 曲艳红, 张蕾. 全反式维甲酸联合奥沙利铂对人SMMC-7721肝癌细胞株的作用. 世界华人消化杂志 2012; 20(10): 851-855
Revised: December 19, 2011
Accepted: March 15, 2012
Published online: April 8, 2012
AIM: To observe the effect of all-trans retinoic acid (ATRA) and oxaliplatin (L-OHP) on the proliferation of human liver cancer SMMC-7721cells.
METHODS: SMMC-7721 cells were treated with ATRA (10-5 mol/L) and/or different concentrations of L-OHP (10, 20 and 40 mg/L) for different durations (24, 48 and 72 h). After treatment, cell proliferation was assessed by MTT assay; cellular morphological changes were observed using an inverted microscope; and cell apoptosis and cell cycle progression were assayed by flow cytometry after cells were treated for 48 h.
RESULTS: ATRA and different concentrations of L-OHP, alone or in combination, significantly inhibited the growth, altered cell morphology, and increased apoptosis of SMMC-7721 cells in a dose - and time-dependent manner. Combined treatment with ATRA and L-OHP had more significant impact on cell growth and apoptosis than either mono-treatment. The growth of cells treated with ATRA and 20 mg/L of L-OHP showed no significant difference with those treated with ATRA and 40 mg/L of L-OHP.
CONCLUSION: ATRA and L-OHP synergistically inhibit the proliferation of human liver cancer SMMC-7721cells.
- Citation: Zhang HP, Yang JM, Zhang S, Qu YH, Zhang L. All-trans retinoic acid and oxaliplatin synergistically inhibit the proliferation of human liver cancer SMMC-7721 cells. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2012; 20(10): 851-855
- URL: https://www.wjgnet.com/1009-3079/full/v20/i10/851.htm
- DOI: https://dx.doi.org/10.11569/wcjd.v20.i10.851
原发性肝癌是病死率很高的恶性消化系肿瘤之一, 其中约90%为肝细胞癌[1]. 药物治疗是失去局部治疗指征的中晚期肝癌的主要治疗手段[2], 但由于化疗疗效差及对肝功能的损伤严重, 目前尚无证据证明能够延长患者生存[3]. 全反式维甲酸(all-trans retinoic acid, ATRA)是维生素A的主要代谢产物[4], 是一种公认的诱导分化剂, 国内外资料显示他能够诱导一些实体瘤细胞分化成熟, 并且有提高实体瘤对化疗敏感性的作用[5]. 奥沙利铂(Oxaliplatin, L-OHP)是第3代铂类抗癌化合物, 与其他铂类药物相似, 其作用机制主要是使肿瘤细胞内DNA形成链间和链内交联, 从而中断DNA合成, 最终产生细胞毒性和抗肿瘤活性[6]. 现多个试验证明, 奥沙利铂具有抑制肝癌细胞增殖及诱导凋亡作用[7], 并已应用于临床. ATRA与L-OHP联用作用于肝癌是否能够提高疗效? 目前尚未见报道. 本实验从体外细胞学的角度观察ATRA与不同浓度L-OH对人肝癌SMMC-7721细胞凋亡的诱导作用以及联用是否增强对人肝癌SMMC-7721细胞抑制作用, 从而为进一步的研究提供理论基础.
人肝癌细胞株SMMC-7721由郑州大学第一附属医院肿瘤实验室馈赠; ATRA购自美国Sigma公司, 用无水乙醇配制成浓度为10-2 mol/L, 储存于-20 ℃冰箱中备用; L-OHP为南京制药厂有限公司生产, 用三蒸水配制成所需浓度; 四甲基偶氮唑盐(MTT)为美国Sigma公司生产, 用PBS液配制成浓度为5 g/L的MTT液, 过滤除菌后贮存于冰箱备用; 二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma公司; DMEM高糖培养基、胎牛血清及胰酶均购自美国Hyclone公司; AnnexinV-FITC凋亡及周期检测试剂盒购自联科生物技术有限公司.
1.2.1 细胞的复苏、培养: 将人肝癌SMMC-7721细胞株从液氮罐中取出, 并于37 ℃恒温水浴箱中迅速复苏, 700 r/min离心5 min, 用含150 mL/L胎牛血清的DMEM培养液, 在饱和湿度、50 mL/L CO2、37 ℃恒温细胞培养箱中培养, 隔天细胞换液1次, 每2-3 d传代1次.
1.2.2 MTT法测细胞生长抑制率: 取对数生长期SMMC-7721细胞, 用胰酶消化成单细胞悬液, 调整细胞密度至3×104/mL, 接种于96孔板, 每孔100 μL. 实验共分为8组, 分别为: 对照组(1 mL/L的无水乙醇), ATRA组(10-5 mol/L)、10 mg/L L-OHP组、20 mg/L L-OHP组、40 mg/L L-OHP组和联合组1(ATRA终浓度为10-5 mol/L、L-OHP终浓度为10 mg/L)、联合组2(ATRA终浓度为10-5 mol/L、L-OHP终浓度为20 mg/L)及联合组3(ATRA终浓度为10-5 mol/L、L-OHP终浓度为40 mg/L), 每个浓度设5个复孔, 加药后分别于37 ℃恒温箱中培养24 h、48 h、72 h, 并在倒置显微镜下观察细胞形态变化. 每孔吸出上清液后加入5 g/L的MTT溶液20 μL, 恒温箱培养4 h后吸出上清液, 每孔加入DMSO 150 μL振荡10 min, 并在自动酶标仪上检测490 nm处各孔的吸光度(A)值. 细胞生长抑制率(%) = (1-药物组A490值均值/对照组A490值均值)×100%.
1.2.3 流式细胞术测细胞周期及凋亡: 取对数生长期细胞, 消化成单细胞悬液, 按1×105/mL的密度接种于6孔板内, 每孔2 mL, 实验共分为4组: 第1组为对照组不加药, 加入等体积的培养液; 第2组为ATRA组(浓度为10-5 mol/L); 第3组为L-OHP组(浓度为20 mg/L); 第4组为联合组(ATRA的终浓度为10-5 mol/L, L-OHP的终浓度为20 mg/L); 根据MTT实验结果, 药物作用48 h时细胞抑制最为明显, 恒温箱培养48 h, 消化收集细胞, 移入离心管中, 700 r/min离心5 min, 弃上清, 加入PBS液至0.5 mL并重悬细胞2次. 测周期时每管加入混有RNase A和PI的Cell cycle staining solution l mL, 并4 ℃避光染色30 min; 测凋亡则每管加入1×buffer 1 mL及AnnexinFITC、PI各5 μL; 分别在流式细胞仪上进行细胞周期及细胞凋亡测定.
统计学处理 采用SPSS17.0软件进行统计学处理. 实验数据采用mean±SD表示, 采用单因素方差分析加LSD两两比较法进行分析, 检验水准α = 0.05, P<0.05为有统计学意义, P<0.01为有显著统计学差异.
倒置显微镜下可见, 正常细胞生长良好, 呈梭形及长条不规则形, 胞体透亮, ATRA作用48 h后, 细胞间隙增宽, 可见部分细胞断裂成碎片, 呈凋亡改变; 20 mg/L L-OHP作用48 h后基本同ATRA. 联合组作用48 h后可见多数细胞漂浮于培养液中, 少量仍贴壁生长, 并可见大部分细胞断裂成碎片, 凋亡改变明显, 细胞明显减少; 作用72 h后, 凋亡细胞数量增多不明显(图1).
ATRA可以抑制SMMC-7721细胞增殖, 作用48 h抑制最为明显; 不同浓度的L-OHP均可显著抑制SMMC-7721肝癌细胞的生长, 并呈剂量-时间依赖性; 两药联合较单药相比作用明显增强(P<0.01); ATRA联合40 mg/L L-OHP与ATRA联合20 mg/L L-OHP相比, 在48 h及72 h时, 二者A490值无统计学差异(P<0.05, 表1, 图2).
| 分组 | A490值 | ||
| 24 h | 48 h | 72 h | |
| 对照组 | 0.832±0.063 | 1.068±0.087 | 1.125±0.112 |
| ATRA组 | 0.597±0.064a | 0.698±0.096a | 0.702±0.069a |
| 10 mg/L L-OHP组 | 0.797±0.054 | 0.967±0.086a | 0.985±0.113a |
| 20 mg/L L-OHP组 | 0.705±0.064a | 0.873±0.094a | 0.864±0.102a |
| 40 mg/L L-OHP组 | 0.618±0.057a | 0.692±0.083a | 0.699±0.095a |
| 联合组1 | 0.579±0.045ade | 0.567±0.052ade | 0.563±0.061ade |
| 联合组2 | 0.477±0.062ade | 0.398±0.079ad | 0.404±0.038ad |
| 联合组3 | 0.372±0.072ad | 0.374±0.048ad | 0.378±0.058ad |
ATRA作用于SMMC-7721细胞后出现G0/G1期阻滞; L-OHP作用于SMMC-7721细胞后出现S期阻滞; 二者联用后S期阻滞明显增强; ATRA及L-OHP均可诱导细胞凋亡, 但二者联用较单药相比, 细胞凋亡比例呈显著性增加, 二者有协同作用(P<0.01, 表2).
国内外研究证实, ATRA不仅对于维持正常上皮细胞的生长和分化具有重要的作用, 而且可在细胞水平上诱导多种实体肿瘤细胞的分化, 抑制肿瘤细胞增殖, 诱导凋亡, 逆转其增殖、浸润、转移等恶性表型[8], 近年来, ATRA在临床上除了用于治疗白血病之外, 也已经用于其他肿瘤的治疗, 如食管癌、胃癌、大肠癌等[9], 刘景等[10]实验证明ATRA能够诱导人肝癌细胞SMMC-7721及Huh-7的凋亡, 抑制细胞增殖. L-OHP是继顺铂和卡铂之后的第3代铂族金属抗肿瘤药物, 最显著的特点是不与顺铂、卡铂等产生交叉耐药性或交叉度低[11], 近年来, L-OHP应用于肝癌亦取得一定效果, 江敏华等[12]实验证实, L-OHP具有抑制SMMC-7721细胞增殖及通过内源性凋亡途径诱导凋亡作用. 邵应举等[13]将ATRA联合L-OHP应用于胃癌, 发现二者有协同诱导胃癌细胞凋亡的作用, 但目前尚没有ATRA联合L-OHP应用于肝癌的报道.
本研究结果显示: ATRA组的24 h、48 h、72 h A490值与对照组相比, 二者有统计学差异(P<0.05), ATRA对SMMC-7721细胞有明显抑制作用; L-OHP各剂量组(10 mg/L、20 mg/L、40 mg/L)与对照组相比, 其24 h、48 h及72 h抑制率均有显著差异, 并呈剂量时间依赖性, 对SMMC-7721细胞均有显著抑制作用(10 mg/L L-OHP组24 h除外); 联合组较ATRA组及L-OHP组相比, 其24 h、48 h及72 h A490值均有显著性统计学差异(P<0.01), 表明ATRA与L-OHP联合具有协同抑制作用; ATRA联合20 mg/L L-OHP与ATRA联合40 mg/L L-OHP相比, 作用细胞48 h及72 h时, 其A490值无统计学差异, 二者对细胞生长抑制作用无统计学意义, 表明ATRA联合较少剂量L-OHP即可能达到目标治疗作用, 为减少化疗用药剂量及减轻化疗不良反应方面开辟了新的思路. 流式结果显示: 与正常细胞组比较, ATRA作用细胞后G0/G1期的细胞比率明显增加, G2/M期的细胞比率下降, L-OHP作用细胞后S期细胞比率增加, G0/G1及G2/M期的细胞比率下降, 联合组作用细胞后S期细胞比率明显增加, G0/G1期和G2/M期细胞比率下降, 各实验组的凋亡率与对照组相比均有显著性差异(P<0.05), 联合组与ATRA组、L-OHP组相比, 凋亡率有显著统计学差异(P<0.01), ATRA与L-OHP联合在诱导SMMC-7721细胞凋亡中发挥显著的协同作用.
本实验表明, ATRA与L-OHP联合作用于SMMC-7721细胞不仅具有协同作用, 且能降低L-OHP的用量, 从而减少化疗的不良反应, 为肝癌治疗提供了新的实验依据, 拓宽了肝癌综合化疗的思路, 但若将其推广应用于临床, 还需要更深入的研究.
原发性肝癌是病死率很高的恶性消化系肿瘤之一, 药物治疗是失去局部治疗指征的中晚期肝癌的主要治疗手段, 但由于化疗疗效差及对肝功能的损伤严重, 目前尚无明确有效的药物治疗.
王蒙, 副教授, 中国人民解放军第二军医大学附属东方肝胆外科医院肝外综合治疗一科
多个实验表明ATRA能够诱导一些实体瘤细胞分化成熟,并且有提高实体瘤对化疗敏感性的作用, 奥沙利铂具有抑制肝癌细胞增殖及诱导凋亡作用, 并已应用于临床.
邵应举等将ATRA联合L-OHP应用于胃癌, 发现二者有协同诱导胃癌细胞凋亡的作用.
本实验表明ATRA与L-OHP联合作用于SMMC-7721细胞不仅具有协同作用, 且能减少L-OHP的用量, 从而减轻化疗的不良反应, 减少耐药, 为肝癌的治疗提供了新的实验依据, 拓宽了肝癌综合化疗的思路, 但若将其推广应用于临床, 尚需更深入的研究.
本实验结构设计严谨, 选题密切结合临床, 观点新颖, 为肝癌的内科治疗提供了新的实验依据, 拓展了肝癌综合化疗的思路.
编辑: 曹丽鸥 电编: 闫晋利
| 2. | 姜 子瑜, 华 海清, 杨 爱珍, 秦 叔逵. 复方苦参、奥沙利铂及重组人血管内皮抑素联合对人肝癌细胞株SMMC-7721凋亡的影响. 世界华人消化杂志. 2010;18:3396-3401. [DOI] |
| 6. | Chlapek P, Redova M, Zitterbart K, Hermanova M, Sterba J, Veselska R. Enhancement of ATRA-induced differentiation of neuroblastoma cells with LOX/COX inhibitors: an expression profiling study. J Exp Clin Cancer Res. 2010;29:45. [PubMed] [DOI] |
| 7. | 蔡 宇, 廖 伟, 周 世骥, 唐 勇, 龚 建平, 刘 长安, 李 生伟. 全反式维甲酸增强超声微泡包裹的单纯疱疹病毒胸苷激酶自杀基因治疗荷肝癌裸鼠的效果. 第三军医大学学报. 2011;33:2112-2115. |
| 8. | 蒋 卫, 李 朝英, 王 珊珊, 李 慧, 刘 忠民, 张 超, 李 刚. 全反式维甲酸下调肝癌细胞HepG2内AFP结合蛋白的表达. 中国生物化学与分子生物学报. 2010;26:1009-1015. |
| 9. | 佘 尚扬, 蓝 秀万, 徐 伯赢, 何 敏, 王 秋雁. nm23-H1对全反式维甲酸诱导的人肝癌细胞凋亡及其相关信号转导通路的影响. 基因组学与应用生物学. 2010;29:46-50. |
| 12. | 江 敏华, 童 福易, 甘 建和. 奥沙利铂对人肝癌细胞株SMMC7721的体外抗肿瘤作用. 苏州大学学报(医学版). 2009;29:871-873, 910, 1021. |
| 13. | 邵 应举, 郑 玉玲, 樊 青霞, 赵 培荣. 全反式维甲酸与奥沙利铂在诱导人胃癌BGC-823细胞凋亡中的协同作用. 西安交通大学学报(医学版). 2010;31:454-458. |