修回日期: 2011-02-23
接受日期: 2011-03-08
在线出版日期: 2011-03-28
目的: 研究眼针对腹泻型肠易激综合征(D- IBS)模型大鼠结肠血管活性肠肽(VIP)和水通道蛋白3(AQP3)表达的影响, 探讨眼针对D-IBS模型大鼠结肠水液代谢的调控作用和机制.
方法: SPF级Wistar大鼠30只, 随机分为对照组、D-IBS模型组和眼针组, 每组10只. 采用慢性应激结合束缚方法建立D-IBS大鼠模型. 采用RT-PCR检测结肠VIP的mRNA表达水平变化; 采用Real time-PCR法检测AQP3的mRNA表达水平变化, 采用SABC免疫组织化学法检测结肠AQP3的蛋白表达水平变化.
结果: 与对照组比较, D-IBS模型组结肠VIP的mRNA表达水平显著升高(0.94±0.07 vs 0.64±0.15, P<0.01), 而结肠AQP3的mRNA和蛋白表达水平显著降低(1.09±0.09 vs 7.02±1.25; 0.284±0.020 vs 0.601±0.027, 均P<0.01). 与D-IBS模型组比较, 眼针组结肠VIP的mRNA表达水平显著降低(0.78±0.15 vs 0.94±0.07, P<0.01), 而结肠AQP3的mRNA和蛋白表达水平显著升高(2.33±0.66 vs 1.09±0.09; 0.374±0.03 vs 10.284±0.020, 均P<0.01).
结论: 通过抑制结肠中VIP的表达和分泌及升高AQP3的表达, 调控结肠水液代谢可能是眼针治疗D-IBS的作用机制之一.
引文著录: 王艳杰, 刘慧慧, 刘旭东, 柴纪严, 赵金茹, 王德山. 眼针对腹泻型肠易激综合征模型大鼠结肠水通道蛋白3表达的影响. 世界华人消化杂志 2011; 19(9): 899-904
Revised: February 23, 2011
Accepted: March 8, 2011
Published online: March 28, 2011
AIM: To explore mechanisms underlying therapeutic effects of eye acupuncture against diarrhea-predominant irritable bowel syndrome (D-IBS) by investigating the expression of vasoactive intestinal peptide (VIP) and aquaporin 3 (AQP3) in the colon of D-IBS rats.
METHODS: Thirty male Wistar rats were randomly divided into three groups: control group, D-IBS model group, and eye acupuncture group. D-IBS was induced in rats of the D-IBS model group and eye acupuncture group by chronic stress and constraint. The eye acupuncture group underwent eye acupuncture therapy for 7 d. VIP mRNA expression in the colon was detected by RT-PCR. The mRNA and protein expression of AQP3 in the colon was detected by immunohistochemistry and real-time PCR, respectively.
RESULTS: Compared to the control group, the mRNA expression level of VIP in the colon was increased significantly (0.94 ± 0.07 vs 0.64 ± 0.15, P < 0.01) and the mRNA and protein expression levels of AQP3 in the colon were remarkably decreased (1.09 ± 0.09 vs 7.02 ± 1.25; 0.284 ± 0.020 vs 0.601 ± 0.027, both P < 0.01) in the D-IBS model group. Eye acupuncture therapy remarkably decreased the mRNA expression of VIP (0.78 ± 0.15 vs 0.94 ± 0.07, P < 0.01) but significantly increased the mRNA and protein expression of AQP3 (2.33 ± 0.66 vs 1.09 ± 0.09; 0.374 ± 0.03 vs 10.284 ± 0.020, both P < 0.01) in D-IBS rats.
CONCLUSION: Oversecretion of VIP and hyposerection of AQP3 may be involved in the pathogenesis of D-IBS. Eye acupuncture therapy exerts therapeutic effects against D-IBS in rats possibly by down-regulating VIP expression and up-regulating AQP3 expression in the colon.
- Citation: Wang YJ, Liu HH, Liu XD, Chai JY, Zhao JR, Wang DS. Eye acupuncture therapy up-regulates aquaporin 3 expression in the colon of rats with diarrhea-predominant irritable bowel syndrome. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2011; 19(9): 899-904
- URL: https://www.wjgnet.com/1009-3079/full/v19/i9/899.htm
- DOI: https://dx.doi.org/10.11569/wcjd.v19.i9.899
眼针是辽宁中医药大学著名中医彭静山教授在多年临床实践的基础上创立的根据眼球结膜上血管的形色变化, 判定疾病的性质与部位, 然后辩证针刺眼周特定穴区, 以治疗全身疾病的一种中医特色疗法. 本课题组多年的临床实践表明眼针对胃肠功能具有较好的调整作用, 在治疗胃肠道功能性疾病和腹痛、腹泻方面具有显著疗效. 因此本课题组建立了腹泻型肠易激综合征(diarrhea-predominant irritable bowel syndrome, D-IBS)大鼠模型, 通过观察眼针对该模型大鼠结肠中血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide, VIP)和水通道蛋白3(aquaporin 3, AQP3)表达的影响, 探索眼针对D-IBS模型大鼠结肠水液代谢的调控机制, 从而为眼针治疗D-IBS提供实验依据.
SPF级♂Wistar大鼠30只, 周龄6-7 wk, 北京维通利华实验动物技术有限公司提供, 许可证编号: SCXK(京)2007-0001, 体质量220 g±20 g; RNAisoTM Plus(TaKaRa Code. D9108); SYBR® PrimeScriptTM RT-PCR Kit(Perfect Real time)(TaKaRa Code. DRR063A), TaKaRa DNaseⅠ(RNase Free)(TaKaRa Code. D2215); Easy Dilution(for Real time PCR)(TaKaRa Code.D9160); PrimerScriptTM RT-PCR Kit(TaKaRa Code. DRR014); in vitro Transcription T7 Kit(TaKaRa Code. D6140); AQP3抗体(美国ADL公司); WD-9413B凝胶成像分析仪; Mycycler Thermal Cycler梯度PCR; TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice Real time System(TaKaRa Code.TP800); RM2235型手动石蜡切片机, EG1150C型包埋机, HI1220型烘片机(德国LEICA), BX51型Olympus反射荧光显微镜(日本Olympus).
1.2.1 造模: SPF级♂Wistar大鼠30只, 按照随机数字法分为: 对照组、D-IBS模型组和眼针组, 每组10只, 分笼饲养, 适应饲养环境1 wk后, 开始建立D-IBS模型. 以Katz等[1]的慢性应激法与Williams等[2]的束缚方法结合建立D-IBS模型. D-IBS的模型评价参考王艳杰等[3]的报道.
1.2.2 眼针治疗方法: 本实验采用慢性应激与束缚结合方法建立D-IBS模型, 中医辨证属于肝郁脾虚模型, 因此在D-IBS模型建立成功后, 根据辨证取穴, 针刺: 下焦区、大肠区、肝区、脾区, 针刺方法: 用31号13 mm毫针, 于大鼠眶缘处, 采用眶上横刺法, 按照穴区定位线1→8的顺序, 从该穴区定位线一端进针, 横刺进针3 mm, 到另一定位线, 留针20 min, 10 min时刮针1次, 刮针5下.
1.2.3 RT-PCR测定结肠VIP mRNA的表达水平: 取100 mg结肠组织, 加入1 mL的RNAisoTM Plus, 按说明书提取总RNA, 溶于DEPC处理的去离子水, 然后进行RNA的含量与纯度测定, 取A260/A280 = 1.8-2.0的总RNA进行逆转录合成cDNA, 取5 μL逆转录产物作为模板在25 μL体系中进行PCR扩增, 引物序列见表1. 反应条件为94 ℃预变性2 min; 94 ℃ 30 s, 65 ℃ 30 s, 72 ℃ 1 min, 共30个循环; 72 ℃延伸5 min. 将扩增产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳, 采用溴化乙锭染色, 把凝胶放入凝胶成像分析仪, 拍照后用Gelpro32软件测量目的基因和内参的平均A值, 并计算两者的比值, 以该比值反应目的基因VIP mRNA的表达水平.
| 序列 | 大小(bp) | |
| β-actin | 5'-TGTATGCCTCTGGTCGTACCAC-3' | |
| 5'-ACAGAGTACTTGCGCTCAGGAG-3' | 592 | |
| VIP | 5'-GCTGCCGTGTTACATAAAGCAA-3' | |
| 5'-AAGCTCCAGGTTGGAAGTTGAG-3' | 210 | |
| Actb-F | 5'-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC-3' | 171 |
| Actb-R | 5'-ATGGAGCCACCGATCCACA-3' | |
| Aqp3-F | 5'-GCCATTGTTGACCCTTATAACAAC-3' | 150 |
| Aqp3-R | 5'-AGTGAAAAGGCGAGGTCCAA-3' |
1.2.4 Real-time PCR测定结肠AQP3 mRNA的表达水平: 采用Real-time PCR方法对AQP3基因的mRNA进行相对表达量分析. 利用RNAisoTM Plus进行总RNA的提取, 用DNaseⅠ处理、精制后, 利用SYBR® PrimeScriptTM RT-PCR Kit采用SYBR GreenⅠ荧光染料嵌合法, 以Total RNA反转录获得的cDNA作为标准品, 分别对管家基因Actb和目的基因AQP3制作标准曲线. 采用双标准曲线法进行结果分析, 利用标准曲线分别对各样品管家基因和目的基因进行定量, 通过管家基因的校正, 对各样品目的基因相对表达量进行分析. 引物序列见表1.
1.2.5 SABC免疫组织化学法测定结肠组织AQP3的蛋白表达水平: 利用多聚赖氨酸进行防脱片处理, 切片常规脱蜡至水. 3% H2O2灭活内源性酶, 蒸馏水洗3次. 热修复抗原, 冷却后PBS洗涤1-2次. 滴加5% BSA封闭液, 室温20 min. 滴加适当稀释的AQP3抗体(1∶100), 4 ℃过夜. PBS洗2 min/3次. 滴加生物素化山羊抗小鼠IgG, 20 ℃-37 ℃孵育20 min. PBS清洗, 5 min×2次. 滴加试剂SABC, 在室温下孵育30 min. PBS清洗, 5 min×4次. DAB显色, 室温显色, 镜下控制反应时间. 蒸馏水洗涤. 苏木素轻度复染, 脱水, 透明, 封片. 显微镜观察, 拍照. 采用BI2000医学图像分析系统进行图像分析, 选取200倍图像, 观察结肠黏膜, 细胞质呈棕黄色为AQP3阳性表达细胞, 每张切片随机选取3-5个高倍视野测定平均A值, 平均A值代表阳性表达参数, 平均A值越大, 阳性表达越强.
统计学处理 实验数据运用SPSS13.0处理, 以mean±SD表示实验结果, 进行多组数据的方差分析, 组间比较采用LSD法. P<0.05为有统计学意义.
对照组结肠VIP的相对表达量为0.64±0.15, D-IBS模型组结肠VIP的相对表达量为0.94±0.07, 与对照组比较, D-IBS模型组大鼠结肠VIP mRNA表达明显上调(P<0.01). 经过眼针治疗后, 眼针组结肠VIP的相对表达量为0.78±0.15, 与D-IBS模型组比较, 眼针组结肠组织中VIP mRNA表达明显下调(P<0.01), 与对照组比较无显著性差异(P>0.05, 图1).
对照组结肠AQP3的相对表达量为7.02±1.25, D-IBS模型组结肠AQP3的相对表达量为1.09±0.09; 与对照组比较, D-IBS模型组结肠AQP3的mRNA表达水平显著降低, 差异有统计学意义(P<0.01); 眼针治疗后, 眼针组结肠AQP3的相对表达量为2.33±0.66, 与D-IBS模型组相比, 眼针组结肠AQP3的mRNA表达水平显著升高(P<0.01, 图2).
光镜下观察, 对照组结肠AQP3的阳性细胞数目最多, 着色最深, 眼针组阳性细胞数目和着色居中, 而D-IBS模型组阳性细胞数目最少和着色最浅. 免疫组织化学图像分析平均A值的结果表明: 对照组平均A值为0.601±0.027, D-IBS模型组平均A值为0.284±0.020, 与对照组比较, D-IBS模型组AQP3的蛋白表达水平显著降低(P<0.01); 眼针组平均A值为0.374±0.031, 且和D-IBS模型组比较, 眼针组AQP3的蛋白表达水平显著升高(P<0.01, 图3).
眼针是辽宁中医药大学基础医学院彭静山教授根据《内经》"观眼察病"和《证治准绳》对眼的脏腑划分理论, 于1974年开创的一种独特的针刺疗法[4,5]. 《灵枢•邪气脏腑病形》云: "十二经脉, 三百六十五络, 其血气皆上于面而走窍, 其精阳气上走于目而为之精. "因此, 彭静山教授认为: 脏腑功能失调可通过经络反映于眼, 而眼针又通过对经络的调节, 起到调整脏腑经络气血, 平衡阴阳之目的. 只需在眼眶边缘穴区施针, 就可以达到疏通经络、调节脏腑治疗全身疾病的目的.
IBS是指一种以腹痛或腹部不适伴有排便习惯改变和(或)大便性状异常的功能性肠病, 该病缺乏可解释症状的形态学改变和生化异常, 根据IBS的临床特点, 中医学将其归于"泄泻"、"腹痛"、"便秘"等疾病范畴[6]. 现代医学目前尚无有效的治疗方法, 但是中医临床研究[7]和系统评价研究[8]表明中医药治疗IBS具有特色和优势. 邱冰峰[9]明确指出抑郁恼怒或精神紧张等情志因素导致肝气郁滞, 气机不畅, 不通则痛而引起腹痛; 肝失疏泄, 横逆犯脾, 脾失运化而发为泄泻; 或肝气郁滞, 气机升降失调, 大肠传导滞涩则发生便秘. 而针刺或艾灸或针药结合等多种方法可以治宜疏肝理气, 健脾和胃, 通腑调肠, 而达到其治疗作用[10]. 本课题组多年来的临床实践也表明, 针刺眼周能够调整多脏腑的功能, 尤其对胃肠功能具有较好的调整作用, 在治疗胃肠道功能性疾病和腹痛、腹泻方面疗效显著. 为了进一步探索眼针是如何作用于内脏及其调整胃肠道功能的机制, 本课题组提出五脏六腑之精华皆注于目, 脏腑功能气血盛衰均与眼穴相关联, 眼针刺激外周相关穴位, 能够启动靶器官神经递质、细胞因子等释放和分泌, 从而调控脏腑的各种代谢、改善其功能. 为了证明这一假说, 本课题组建立了D-IBS大鼠模型, 并采用眼针治疗, 通过测定结肠VIP和AQP3的表达变化, 来探索眼针的作用机制, 从而为丰富眼针的中医理论基础内涵提供现代医学依据.
IBS临床根据罗马Ⅲ诊断标准分为便秘型、腹泻型、混合型及未定型4个分型, 姚欣等[11]的研究结果显示照罗马Ⅲ诊断标准, D-IBS最多见, 约占2/3, 所以粪便中含水量则是IBS分型的重要依据[12,13]. 近年来的研究发现, D-IBS患者及动物模型的结肠黏膜上皮细胞水通道蛋白(aquaporins, AQPs)表达发生明显改变[14-17]. 因此结肠AQPs表达的变化和机制成为研究D-IBS发生的新热点. AQPs在肠道上皮细胞大量表达, 肠道水代谢是其主要功能之一, 因此推测其表达的变化与肠道水代谢之间可能存在较为重要的关系[18]. 几种特异性AQPs能够易化肠道内水的转运. 其中AQP3对人类肠表面细胞水的转运很重要. Ramírez-Lorca等[19]的研究结果显示AQP3 mRNA在结肠表达明显多于小肠和胃. Julian等[20]通过对小鼠腹泻模型研究发现, 在病情活动期时结肠AQP3表达降低, 病情好转后AQP3蛋白表达恢复到正常水平. Silberstein等[21]研究发现AQP3高表达可引起结肠黏膜对水的吸收增加而导致便秘, AQP3的低表达可引起结肠黏膜对水吸收减少而导致腹泻或便溏. 重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)大鼠回肠黏膜AQP3蛋白及mRNA表达均较假手术组明显上调, 差异均有统计学意义(均P<0.05), 且以24 h时更为显著; AQP3参与了SAP大鼠的病理生理改变, 这可能是肠黏膜通透性增高的机制之一[22]. 杨会锋等[23]研究发现结肠全段均有AQP3的表达, 提示结肠AQP3参与结肠重要生理功能之一. 从以上研究结果分析, AQP3在结肠的水转运中具有重要作用, 其表达变化可以引起腹泻或便秘. 本实验结果表明D-IBS模型大鼠结肠组织AQP3的mRNA和蛋白表达与对照组相比均有下降. 由此推测D-IBS模型大鼠出现腹泻的症状可能与AQP3表达下调后影响了结肠内水转运有关.
以往的研究资料表明无论是结肠功能紊乱或是AQPs表达发生变化都与体内, 特别是结肠组织中VIP含量变化有关, 表明VIP可能通过调控AQPs的表达对D-IBS腹泻产生影响. 冯璟等[24]研究表明VIP作用下的HT-29细胞AQP8 mRNA和蛋白的表达均增加, 提示AQPs可能是VIP作用的靶分子之一. 以VIP孵育人类结肠上皮细胞系HT-29, 可发现AQPs mRNA表达上调, cAMP反应元件的DNA结合活性增强; 蛋白激酶A抑制剂H-89则可以阻断由VIP和cAMP对AQPs mRNA表达的上调作用. Itoh等[25]研究显示, VIP通过cAMP依赖的途径上调AQPs及其mRNA表达研究显示VIP通过cAMP依赖的途径上调AQP3 mRNA和蛋白表达, 推测VIP参与便秘发生与上调AQP3表达, 从而促进水分的吸收有关. AQPs是一类糖蛋白家族, 多种AQPs都含有PKA和蛋白激酶C的同源序列, 所以能够直接接受磷酸化调节. 由于VIP属于含氮物质, 其VIP1-R属于G蛋白耦联型受体; 有报道[26]提出, VIP可以通过细胞蛋白激酶A系统来改变膜上AQP的含量, 以调节跨膜水流动, 从而调节膜对水的通透性. VIP是肠内分泌的一种脑肠肽类激素, 可以促进肠道水和电解质的分泌. 胃肠上皮细胞基底膜有VIP的受体, 当其与VIP结合时, 刺激细胞中的cAMP的蓄积, 促进肠上皮细胞分泌电解质和水分. 静脉注射VIP能够引起分泌性腹泻, 增加血浆中VIP浓度能够引起结肠炎腹泻, 这表明VIP在肠道水的转运过程中起重要作用. 近年在对IBS发生机制的研究中发现, IBS患者在腹痛、腹泻等症状出现的同时, 往往伴有血与结肠组织中VIP含量升高[27,28], 但是学者认为, D-IBS患者结肠黏膜VIP表达升高可能是肠动力增强后的一种负反馈机制[29]. 姜道亮等[30]的实验发现, 外周血中以及大鼠回肠末端、远端结肠, VIP的表达均较对照组明显增加, 且差异有显著性(P<0.05), 因此VIP的表达可以作为判断肠功能紊乱动物模型的一个有价值的指标. 本实验结果显示, IBS模型大鼠血清和结肠组织VIP含量改变与既往的研究结果一致, 提示VIP与IBS的腹痛、腹泻发生有着密切关系.
本实验结果显示, D-IBS模型大鼠结肠组织VIP mRNA表达水平升高, 同时AQP3的表达水平降低, 说明D-IBS模型大鼠结肠组织VIP mRNA水平的增高, 可能下调了结肠黏膜细胞AQP3的表达而影响了结肠内水的转运, 导致水吸收减少. 由于结肠腔内存水量的增加, 不但能够引起腹痛及腹泻发生, 同时由于结肠内水分增多则提高了结肠的敏感性, 通过"脑-肠轴"途径反射性地调控了肠道神经-体液-免疫网络系统活动, 进而加剧了结肠组织的运动和分泌功能的异常, 导致IBS状态下腹痛、腹泻等症状的发生.
本实验结果显示, 眼针还可能通过降低D-IBS模型大鼠的结肠组织的VIP mRNA的表达, 增加结肠黏膜细胞AQP3的表达, 由此不但促进了结肠内水的转运, 同时由于结肠残存的水液减少还可能降低了结肠组织的高敏感性, 从而达到减轻或缓解了D-IBS的腹痛、腹泻等症状. 至于眼针抑制VIP分泌与释放, 以及VIP调控AQP3表达的具体机制有待于进一步研究明确.
IBS临床根据罗马Ⅲ诊断标准分为便秘型、腹泻型、混合型及未定型4个分型, D- IBS最多见, 约占2/3, 所以粪便中含水量则是IBS分型的重要依据. 近年来的研究发现, D-IBS患者及动物模型的结肠黏膜上皮细胞水通道蛋白(AQPs)表达发生明显改变.
郑培永, 副研究员, 上海中医药大学脾胃病研究所
结肠AQPs表达的变化和机制成为研究D-IBS发生的新热点.
杨会锋等研究发现结肠全段均有AQP3的表达, 提示结肠AQP3参与结肠重要生理功能之一.
通过抑制结肠中VIP的表达和分泌及升高AQP3的表达, 调控结肠水液代谢可能是眼针治疗D-IBS的作用机制之一.
本文科学性较好, 具有较好的临床参考价值.
编辑:曹丽鸥 电编:何基才
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