β2糖蛋白I与乙型肝炎表面抗原的结合作用

摘要

目的: 探讨慢性乙型肝炎(CHB)患者血清与β2糖蛋白I(β2-GPI)结合的影响因素.

方法: 利用¹²⁵I标记rHBsAg和β2-GPI, 通过液相放射免疫法分别测定血浆中β2-GPI、大肠杆菌M15表达的rβ2-GPI与¹²⁵I-HBsAg的结合常数(Ka). 选取23例血清, 其中CHB HBeAg阳性组9例, CHB HBeAg阴性组9例, 正常对照组5例, 测定其与¹²⁵I-β2-GPI的结合率.

结果: 血浆β2-GPI组和rβ2-GPI组的Ka值分别为(2.795±1.846)×10⁸ L/mol、(3.001±1.049)×10⁸ L/mol. 利用嵌套实验设计分析, 两组来源不同的β2-GPI的结合常数(Ka₁、Ka₂)无统计学差异. HBeAg阳性组与阴性组的结合率具有统计学差异(33.200%±11.960% vs 54.540%±9.990%, P<0.05). 并发现HBeAg阳性组内的不同水平ALT的结合率有差异(42.392%±6.860% vs 21.720%±1.442%, P<0.05).

结论: 血浆中HBsAg与β2-GPI可能有较强的亲和力, β2-GPI的糖基化结构对二者结合作用无影响. HBeAg、ALT影响HBsAg与β2-GPI的结合.

关键词: β2糖蛋白I; 乙型肝炎表面抗原; 蛋白结合

Factors affecting binding of beta 2-glycoprotein I to hepatitis B surface antigen in the serum of patients with chronic hepatitis B

Chuan He, Pu-Jun Gao, Xue Jing, Yang Wu

Chuan He, Yang Wu, Department of Emergency Medicine, the First Hospital of Jilin University, Changchun 130000, Jilin Province, China

Pu-Jun Gao, Department of Hepatology, the First Hospital of Jilin University, Changchun 130000, Jilin Province, China

Xue Jing, Department of Gastroenterology, the Affiliated Hospital of Medical College of Qingdao University, Qingdao 266000, Shandong Province, China

Supported by: the Science Foundation of Jilin Province, No. 200705106.

Correspondence to: Professor Pu-Jun Gao, Department of Hepatology, the First Hospital of Jilin University, 71 Xinmin Avenue, Changchun 130000, Jilin Province, China. pujun-gao@163.com

Received: December 7, 2010
Revised: March 5, 2011
Accepted: March 16, 2011
Published online: March 28, 2011

Abstract

AIM: To investigate factors affecting binding of beta 2-glycoprotein I (β2-GPI) to hepatitis B surface antigen (HBsAg) in the serum of patients with chronic hepatitis B (CHB).

METHODS: Recombinant HBsAg (rHBsAg) was radiolabeled with Na ¹²⁵I and used to measure the affinity constant (Ka) of serum β2-GPI or recombinant β2-GPI with HBsAg. Serum samples were collected from 9 HBeAg-positive, 9 HBeAg-negative CHB patients and 5 normal controls to measure the binding rate of ¹²⁵I-β2-GPI with serum HBsAg.

RESULTS: There was no statistically significant difference between the affinity constants of serum β2-GPI and recombinant β2-GPI with HBsAg [(2.795 ± 1.846) × 10⁸ L/mol vs (3.001 ± 1.049) ×10⁸ L/mol]. A significant difference was noted in the binding rate of I-β2-GPI with HBsAg between HBeAg-positive and -negative patients (33.200% ± 11.960% vs 54.540% ± 9.990%, P < 0.05) and between HBeAg-positive patients with different ALT levels (42.392% ± 6.860% vs 21.720% ± 1.442%, P < 0.05).

CONCLUSION: The binding affinity of β2-GPI to serum HBsAg is strong in CHB patients, which is not affected by the glycosylation of β2-GPI. HBeAg and ALT levels affect the binding of HBsAg to β2-GPI in the serum of CHB patients.

Key Words: Beta 2-glycoprotein I; Hepatitis B surface antigen; Protein binding

0 引言

HBV感染具有多种临床转归, 包括最初隐匿感染到终末期肝病和肝细胞癌, 自然病程持续数十年. 在自限性感染中, 最关键的是早期HBsAg的清除和HBsAb的产生, 但若HBV持续存在, 将发展为慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)或CHB携带者. 虽然每年近0.5%-1.0%的乙型肝炎携带者能够实现HBsAg转阴, 并且大多数可以产生HBsAb[1]. 但HBsAg持续存在将增加患者发展为肝细胞癌的危险度. 研究已明确这种进行性疾病与一些危险因素有关, 包括年龄、男性、HBV基因C型、HBV DNA高复制水平以及长期饮酒史[2]. 针对HBV这种强嗜肝性人们进行广泛的研究. β2糖蛋白I(beta 2-glycoprotein I, β2-GPI)是血浆中一种较丰富的蛋白, 是多种脂蛋白的组成成分. 研究表明, β2-GPI可与重组乙型肝炎病毒表面抗原(recombinant hepatitis B surface antigen, rHBsAg)特异性结合[3], 推断β2-GPI可能参与HBV嗜肝过程. 本研究组已鉴定出β2-GPI在肝细胞膜上的结合蛋白-膜联蛋白Ⅱ(Annexin Ⅱ), 并提出β2-GPI可能作为HBsAg的中介分子参与HBV的感染[4]. 本研究利用放射性免疫分析法(radioimmunoassay, RIA)进一步测定二者的结合常数(Ka), 并通过测定CHB患者血清与β2-GPI的结合率, 初步探讨β2-GPI与HBsAg结合的影响因素, 以期为HBV嗜肝机制研究提供实验基础.

1 材料和方法

1.1 材料

碘化钠-¹²⁵I购自成都中核高通同位素股份有限公司; HBsAg阳性血清标准品, 购自中国药品生物制品检定所; 人血浆中提取的β2-GPI, 由江苏大学基础医学院惠赠; 重组菌pQE30-hβ2-GPI由吉林大学白求恩第一医院中心实验室提供; 人rHBsAg由吉林省长春生物制品研究所惠赠; 镍离子亲和层析柱(Ni²⁺-NTA)购自Qiagen公司; DNaseⅠ酶购自美国Phrmacia公司.

1.2 方法

1.2.1 ¹²⁵I标记rHBsAg和β2-GPI: 采用氯胺-T法. 将218 mg/L的HBsAg用20 mmol/L pH7.5 PBS溶液稀释为10 mg/L, 共标记3组. 在反应试管内, 依次加入HBsAg 0.5 g/L, Na ¹²⁵I 3.7×10¹² Bq/L, 氯胺-T 10 g/L, 混匀, 反应约2 min. 再加入10 g/L偏重亚硫酸钠, 混匀, 终止反应. 经SephadexG-25柱纯化, 每组15管. 通过上述同样方法标记β2-GPI. 每管样品均经放射免疫γ-测量仪测量每分钟计数率(cpm). 计算标记¹²⁵I-HBsAg、¹²⁵I-β2-GPI的比活度.

1.2.2 重组β2-GPI的表达: 对大肠杆菌M15(hβ2-GPI cDNA/pQE30)进行筛选, 对最佳诱导时间和浓度进行优化. 包涵体选取Ni-NTA凝胶亲和层析, 稀释法和透析法对目的蛋白进行复性, BCA法测定rβ2-GPI的含量.

1.2.3 测定β2-GPI与rHBsAg结合的结合常数: 实验分为两组, 一组为人血浆中提取的β2-GPI, 另一组为大肠杆菌M15表达的rβ2-GPI. 采用竞争结合法, 取梯度反应浓度的β2-GPI、rβ2-GPI, 总反应体积100 μL. 根据最佳结合温度37 ℃, 最佳结合时间为4 h, 均采用双管重复反应. HBsAg阳性血清为标准品, 分离结合部分. 使用放射免疫γ-测量仪测量沉淀物的放射计数. 利用Logit-Log坐标轴上绘制RIA标准曲线, 求得Ka.

1.2.4 测定¹²⁵I-β2-GPI与CHB患者血清的结合率: 共收集23份血清, 包括9份HBeAg阳性、9份HBeAg阴性的CHB患者血清和5份正常对照血清. CHB患者血清相关因素包括HBsAg定量、DNA定量、ALT水平(以于正常上限2倍为界), HBsAg标准品0.5 mL加入PBS 0.5 mL进行倍比稀释, 分别与23份血清结合, 37 ℃水浴, 反应4 h. 取109.4 mg/L ¹²⁵I-β2-GPI加入上述样本中, 反应2 h, 加入分离剂, 离心, 弃上清, 使用放射免疫γ-测量仪测量沉淀物的放射计数.

统计学处理 实验数据以mean±SD表示, 两组β2-GPI与rHBsAg的Ka用浓度(10⁸ mol/L)表示, 采用嵌套实验设计. β2-GPI与患者血清的结合率用百分率(%)表示, 组间采用秩和检验. 以上均以P<0.05具有统计学差异.

2 结果

2.1 ¹²⁵I标记rHBsAg、β2-GPI

绘制经SephadexG-25层析柱分离标记的rHBsAg、β2-GPI和游离碘的洗脱曲线(图1). 计算¹²⁵I标记rHBsAg、β2-GPI的比活度: 125I-rHBsAg的比活度 = (2.6-2.8)×10⁶ Bq/μg; ¹²⁵I-β2-GPI的比活度 = (5.8-6.0)×10⁶ Bq/μg.

图1 SephadexG-25分离标志物洗脱曲线. 第1峰: 标记蛋白峰约在4-6 mL处, 即分别为¹²⁵I标记rHBsAg、β2-GPI; 第2峰: 游离¹²⁵I约在9-11 mL处.

2.2 重组β2-GPI的表达

以75 μg/L的β2-GPI为代表, 筛选最佳反应温度和浓度(图2). 可知在37 ℃和4 h的条件下, 两者呈梯度线性且结合较稳定.

图2 β2-GPI与rHBsAg结合的最佳反应温度与时间曲线图. A: 温度; B: 时间. 梯度浓度的β2-GPI与125I-rHBsAg结合, 分别在4 ℃和37 ℃发生结合反应, 选择时间为2、4、8、12、24 h.

2.3 rβ2-GPI的含量

BCA法测得rβ2-GPI的含量约为260 μg/L(图3).

图3 重组β2-GPI的表达. 1: 标准蛋白Marker; 2,3: β2-GPI.

2.4 两组来源不同的β2-GPI与rHBsAg的Ka值

人血浆β2-GPI组: Ka₁ = (2.795±1.846)×10⁸ L/mol; rβ2-GPI组: Ka₂ = (3.001±1.049)×10⁸ L/mol(表1).

表1 两组β2-GPI与HBsAg结合的Ka (mean±SD).

		人血浆中β2-GPI				E.coli表达的rβ2-GPI
蛋白浓度(μg/L)	1 240	300	75	18	1 300	325	80	20
Ka(108 L/mol)	2.075±0.049	2.250±0.099	5.500±0.665	1.355±0.064	2.055±0.106	2.220±0.028	3.485±0.050	4.245±0.134

F = 0.04, P = 0.8522.

2.5 23份血清与β2-GPI的结合率

经统计学分析, HBeAg阳性组与阴性组的结合率有显著统计学差异(33.200%±11.960% vs 54.540%±9.990%, P<0.05), 且HBeAg阳性组内的结合率有统计学差异(P<0.05, 表2).

表2 HBeAg阳性组与β2-GPI的结合率.

分组	n	结合率(%)
ALT＝N	5	42.392±6.860a
ALT≥2N	4	21.720±1.442

^aP<0.05 vs ALT≥2N. N: ALT正常值.

3 讨论

β2-GPI又称为载脂蛋白H(ApoH), 是一种相对分子质量约为46 000 Da的高度糖基化的血浆蛋白. 具有强亲脂特性, 血浆中约有30%左右的β2-GPI与脂类化合物结合. 他是乳糜微粒(chylomicron, CM)、极低密度脂蛋白(very low density lipoprotein, VLDL)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL)及高密度脂蛋白(high density lipoprotein, HDL)的组成成分. 多年来关于HBV入肝的关键膜受体或中介分子尚未确定. Neurath等[5]鉴定了与HBV表面的脂质结合的多种受体, 后Mehdi等[3]证实了介导rHBsAg与肝细胞膜表面结合的蛋白是β2-GPI, 故推断作为脂蛋白组分的β2-GPI可能与HBV结合后发生变构, 随着CM和HDL入肝. 这种结合具有饱和性, 可被过量的rHBsAg、HBsAb、抗β2-GPI抗体所阻断[6]. 在HCV感染相关研究中也发现有脂蛋白的参与[7]. 本研究组利用肝癌细胞株SMMC-7721鉴定出与人β2-GPI特异结合的蛋白, 即AnnexinⅡ[4], 推断β2-GPI作为HBsAg的桥接分子与AnnexinⅡ组成复合物以某种方式入肝. 研究表明, 这种复合物可激活NF-κB信号转导通路, 可能促进乙型肝炎慢性化和肝细胞癌的发生发展[8]. 同时, 也有研究提示β2-GPI的基因多态性可能是HBV感染肝细胞的原因之一[9]. 本研究通过测定人β2-GPI与rHBsAg的Ka, 说明二者结合力较强, 进而推断二者在血浆中较易形成复合物. 这种复合物很可能与肝细胞表面的AnnexinⅡ或其他膜蛋白结合, 参与CHB的发生与发展.

蛋白质糖基化是蛋白质翻译后的一种加工过程, 在肽链合成的同时或合成后, 在酶的催化下, 糖链被接到肽链上的特定糖基化位点. 有研究发现, 部分蛋白质的糖基化对免疫功能的影响很大[10], 但此方面研究尚不深入. β2-GPI是由326个氨基酸残基组成高度糖基化的单链亲水蛋白, 根据β2-GPI基因克隆和氨基酸序列分析结果, 其结构中可能有4个N端-糖苷键[11]. 学者常用Sf9细胞系统和杆状病毒表达人rβ2-GPI[12], 也有人利用E.coil表达的重组蛋白进行研究[13]. 有研究认为, β2-GPI的第Ⅴ区和第Ⅰ区能与带负电荷磷脂稳定结合, 其糖基化与磷脂的结合能力无关[14]. 在APS研究中发现, β2-GPI与aPL结合后表面结构发生变化, 失去其原有的抗凝作用, 使机体易形成血栓[15], 参与APS的疾病. 另有研究表明, 原核系统表达的rβ2-GPI无糖基化并不影响其免疫活性, 仍被APS自身抗体识别并攻击[13], 糖基化与否并不影响β2-GPI的免疫活性, 即其抗原性不变. 本研究利用原核系统表达蛋白无糖基化的"缺点", 测定无糖基化的rβ2-GPI与HBsAg的Ka, 并与人血浆中β2-GPI的Ka进行比较. 发现两组来源不同的β2-GPI的Ka无差异, 即β2-GPI的糖基化结构并不影响其与HBsAg的结合. 分析上述可能的原因是, β2-GPI是依赖于特定的一级结构上的氨基酸残基肽段与rHBsAg结合, 而与糖基化结构关系不大.

HBeAg是HBV的一种保护性抗原, 他在HBV感染和复制的过程中所起的作用尚不明确. 本研究通过比较3组不同患者血清与β2-GPI的结合率, 得出HBeAg阳性组的β2-GPI结合率与HBeAg阴性组、正常对照组均有差异, 并且ALT的水平也影响结合率. 我们初探到HBeAg、ALT在β2-GPI与HBsAg结合中起到一定的作用, 而具体作用仍需进一步研究. 因此, 将扩大样本量进一步观察HBeAg在HBV感染过程中所起的作用.

总之, β2-GPI作为HBV感染肝细胞的中介分子, 在血浆中与HBsAg结合较强, 且其糖基化结构对二者结合作用无影响. HBeAg、ALT在血清中的作用可能影响HBV的生命周期, 此方面需进一步深入研究.

评论

背景资料

β2糖蛋白I(β2-GPI)是多种脂蛋白的组成成分, 是抗磷脂综合征(APS)的一种自身抗原, 近年研究表明其可能在HBV嗜肝过程中起到关键受体或中介分子的作用.

同行评议者

范小玲, 主任医师, 北京地坛医院综合科

研发前沿

近年来, β2-GPI与乙型病毒性肝炎及肝癌的相关性研究成为新热点.

相关报道

β2-GPI作为HBsAg的桥接分子可激活核因子-κB(NF-κB)信号转导通路, 可能促进乙肝慢性化和肝细胞癌的发生发展.

创新盘点

本研究利用放射性免疫法检验测定β2糖蛋白I与HBsAg的结合常数, 并探讨慢性乙型肝炎患者血清与β2-GPI结合的影响因素, 迄今尚无文献报道.

同行评价

本文从病毒进入细胞途径方面进一步探讨了慢性乙型肝炎发病机制, 并与临床联系, 有较好的研究前景和实际意义.

备注

编辑:曹丽鸥 电编:何基才

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