牛蒡子苷元对肝癌侵袭转移的影响

摘要

目的: 研究牛蒡子苷元(arctigenin, ARG)对肿瘤黏附、侵袭、转移的影响.

方法: 体外实验分别采用MTT法、Transwell法检测ARG对SMMC-7721细胞黏附、侵袭和转移的影响; 体内实验采用裸鼠肺转移瘤模型, 检测ARG对SMMC-7721细胞肺转移的影响.

结果: 与空白对照组相比, ARG作用后SMMC-7721细胞黏附率、侵袭率和转移率显著下降, 其平均黏附抑制率、转移抑制率和侵袭抑制率分别为43.08%、55.19%和58.21%. 随着ARG浓度的增加, 作用时间的延长, ARG对SMMC-7721细胞及细胞黏附的抑制作用显著增强(72 h: 0.260±0.014 vs 0.999±0.066, P<0.05; 4 h: 0.558±0.026 vs 1.241±0.102, P<0.05). 裸鼠SMMC-7721细胞肺转移灶数目显著减少(62.5% vs 100%, P<0.05).

结论: ARG在体外可以抑制SMMC-7721细胞的黏附、侵袭和转移, 在体内可以抑制肿瘤的转移.

关键词: 牛蒡子苷元; 肝癌; SMMC-7721细胞; 黏附; 侵袭; 转移

Treatment with arctigenin inhibits the metastasis and invasion of human hepatocellular carcinoma SMMC-7721 cells

Bing Wang, Guo-Can Zheng

Bing Wang, Guo-Can Zheng, Department of General Surgery, Zhongda Hospital, Southeast University, Nanjing 210009, Jiangsu Province, China

Supported by: the Southeast University Preliminary Research Fund for National Natural Science Foundation, No. XJ0650261.

Correspondence to: Associate Professor Guo-Can Zheng, Department of General Surgery, Zhongda Hospital, Southeast University, Nanjing 210009, Jiangsu Province, China. zgc9252003@yahoo.com.cn

Received: December 23, 2010
Revised: January 22, 2011
Accepted: February 15, 2011
Published online: March 8, 2011

Abstract

AIM: To evaluate the effects of treatment with arctigenin (ARG) on the adhesion, invasion, and metastasis of human hepatocellular carcinoma SMMC-7721 cells.

METHODS: After SMMC-7721 cells were treated with ARG, cell adherence, migration, and invasion were assessed by MTT assay and Transwell migration assay. A model of pulmonary metastasis of SMMC-7721 cells was then generated in nude mice to evaluate the effect of arctigenin on tumor cell metastasis.

RESULTS: The adhesion, migration, and invasion of SMMC-7721 cells were significantly inhibited after ARG treatment. Compared with control cells, the average reduced rates of adhesion, metastasis, and invasion in cells treated with ARG were 43.08%, 55.19% and 58.21%, respectively. ARG inhibited the adhesion of SMMC-7221 cells in a concentration- and time-dependent manner (72 h: 0.260 ± 0.014 vs 0.999 ± 0.066, P < 0.05; 4 h: 0.558 ± 0.026 vs 1.241 ± 0.102, P < 0.05). The number of metastatic pulmonary tumors in nude mice inoculated with arctigenin was lower than that in mice inoculated with control cells (62.5% vs 100%, P < 0.05).

CONCLUSION: Treatment with arctigenin markedly inhibits the adherence, migration and invasion of SMMC-7721 cells.

Key Words: Arctigenin; Hepatic carcinoma; SMMC-7721 cell; Adhesion; Metastasis; Invasion

0 引言

临床上牛蒡子复方制剂治疗感冒等感染性疾病, 以及多种肿瘤及白血病有显著效果, 相关体外细胞学实验有所验证[1,2]. 其有效成分是牛蒡子苷元(arctigenin, ARG). 国外有其在抑制热休克反应中的应用的报道[3], 国内外均有实验报道其有抗病毒[4]、诱导肿瘤细胞凋亡等抗肿瘤作用[5,6]. 但ARG对于肿瘤侵袭、转移方面的研究尚无报道. 本研究通过ARG对肝癌细胞株SMMC-7721的体内、外实验, 探讨其对肿瘤侵袭、转移的影响.

1 材料和方法

1.1 材料

肝癌细胞株SMMC-7721由东南大学医学院中心实验室保存; PRMI 1640细胞培养液(美国Gibco公司); ARG(上海展舒化学科技公司); 酶联免疫检测仪(BIO-RAD550型, 美国BD公司); Transwell Chamber(8 μm孔径)细胞培养小室、Matrigel胶(美国BD公司); ♂BALB/nu/u裸鼠, SPF级, 周龄6-8 wk, 体质量l8-20 g(上海科学院动物实验中心).

1.2 方法

1.2.1 细胞培养: SMMC-7721细胞接种于RPMI 1640培养液(含100 mL/L胎牛血清, 青霉素100 kU/L、链霉素100 kU/L), 于37 ℃, 50 mL/L CO₂及饱和湿度的培养箱中培养. 细胞贴壁生长, 2-3 d传代. 取生长对数期的细胞制成细胞悬液用于实验.

1.2.2 MTT法检测检测ARG对SMMC-7721细胞抑制率: 取SMMC-7721, 制成1×10⁷/L单细胞悬液, 接种于96孔板, 每组5孔, 细胞贴壁后, 弃上清, 据ARG的浓度(DMSO助溶, 终浓度控制在0.3%以下)分为: 0.5、1.0、5.0、10.0 mg/L组, 0.3% DMSO为阴性对照组, 孵育24、48、72 h后, 加入MTT 20 μL, 孵育4 h, 弃上清, 加200 μL DMSO, 振荡5 min, 酶联免疫检测仪测波长570 nm的吸光度值(A值), 每组实验重复3次取均值, 计算抑制率, 并通过POMS软件得出各组的半数抑制浓度(50% inhibitory concentration, IC₅₀). 抑制率 = (1-给药组A值/对照组A值)×100%.

1.2.3 MTT法检测ARG对SMMC-7721细胞黏附的影响: 以70 mg/L的FN包被96孔板, 风干后放入4 ℃冰箱中备用. 根据文献[4], 实验时取1×10⁷/L的SMMC-7721细胞接种于已包被FN的96孔培养板中, 每孔2 001 μL, 设5复孔, 待细胞贴壁后(4-5 h), 加入以培养液配置终浓度为1.0 mg/L的ARG, 空白对照组加入200 μL培养液, 以75 mg/L 5-Fu为阳性对照组, 置于培养箱内分别孵育1、2、4 h, 吸出培养液, 每孔加入5 g/L的MTT 20 mL, 继续培养4 h, 弃去全部上清, 每孔加入DMSO 150 μL, 以下各步骤同上, 按下列公式计算细胞黏附抑制率. 黏附抑制率 = (1-处理组平均A值/对照组平均A值)×100%.

1.2.4 Transwell法检测ARG对SMMC-7721细胞侵袭、转移的影响: Transwell小室杯底为8 μm孔径的聚碳酸酯微孔滤膜, FN封闭、4 ℃过夜. 侵袭实验时Transwell小室铺有Matrigel胶, 下室加入0.5 mL含10%血清培养液, 上室加入含BSA无血清培养液细胞悬液(1×10⁸/L, 200 μL/孔), 各设3个复孔. 实验组为1.5 mg/L ARG, 阴性对照组为不加药物的培养基, 阳性对照组为75 μg/mL 5-Fu. 各组常规37 ℃孵育24 h, 无菌下取出Transwell小室, 棉签擦净上室细胞, PBS漂洗5 min 2次, 4%多聚甲醛固定、0.1%结晶紫染色, 镜下随机计数5个视野的穿膜细胞平均数(400×). 转移能力的测定时不涂胶, 上室加入细胞悬液(1×10⁹/L), 孵育8 h, 余步骤同上. 侵袭(转移)抑制率 = [1-ARG组侵袭(转移)细胞数/对照组侵袭(转移)细胞数]×100%.

1.2.5 ARG对SMMC-7721细胞裸鼠肺转移灶的影响: 取2×107/mL指数生长期的SMMC-7721细胞经裸鼠尾静脉注射, 接种后第8天随机分3组(每组8只): ARG组[50 mg/(kg•d), 腹腔注射]、5-Fu组(5-Fu 17 mg/kg, 每周2次, 腹腔内注射)、空白对照组(无菌生理盐水2 mL/d, 腹腔注射), 连续用药6 wk, 末次用药24 h后处死裸鼠解剖, 观察肺及其他各脏器癌转移灶.

统计学处理 采用SPSS17.0统计软件, 计量资料以mean±SD表示, 计量资料的组间比较采用单因素方差分析, 等级资料的多组比较用H检验, 以P<0.05为差异具有统计学意义.

2 结果

2.1 ARG对SMMC-7721细胞增殖的影响

随ARG浓度的增加, 其抑制作用逐渐增大(表1). 各实验组与对照组比较差异均有统计学意义(均P<0.05), 但是随着作用时间延长, 抑制率并未有明显差异. 通过POMS软件由各药物组结合剂量-抑制曲线得出SMMC-7721细胞24 h的IC₅₀约为1.50 mg/L, 以下实验取低于此浓度观察药物对细胞侵袭转移的抑制.

表1 MTT法检测ARG对SMMC-7721细胞的抑制 (A₅₇₀, mean±SD).

分组	24 h	48 h	72 h
空白对照组	1.242±0.350	1.131±0.039	0.999±0.066
阴性对照组	1.289±0.256	1.192±0.034	1.107±0.061
ARG 0.5 mg/L	0.743±0.052a	0.608±0.035a	0.558±0.026a
ARG 1.0 mg/L	0.452±0.024a	0.420±0.003a	0.399±0.017a
ARG 5.0 mg/L	0.361±0.026ac	0.321±0.007ac	0.300±0.011ac
ARG 10.0 mg/L	0.314±0.006ace	0.292±0.008ace	0.260±0.014ace

^aP<0.05 vs 空白对照组;

^cP<0.05 vs ARG 0.5, 1.0 mg/L;

^eP<0.05 vs ARG 5.0 mg/L.

2.2 ARG对SMMC-7721细胞黏附的影响

实验组各时段的细胞黏附率均明显低于对照组, 各时段及5-Fu组黏附抑制率分别为21.39%、42.75%和65.11%, 各时间段之间差异有统计学意义(表2), 表明ARG对SMMC-7721细胞黏附有抑制作用, 且此作用具有时间依赖性.

表2 MTT法检测ARG对SMMC-7721细胞黏附的影响 (A₅₇₀, mean±SD).

分组	1 h	2 h	4 h
空白对照组	0.893±0.050	1.02±0.0549	1.241±0.102
ARG组	0.702±0.041a	0.584±0.02a	0.433±0.040a
5-Fu组	0.743±0.052a	0.608±0.035a	0.558±0.026a

^aP<0.05 vs 空白对照组.

2.3 ARG对SMMC-7721细胞侵袭、转移的影响

ARG组转移细胞数及侵袭细胞数均明显低于对照组, 转移抑制率和侵袭抑制率分别为55.19%和58.21%(表3). 对照组细胞轮廓清晰, 活力旺盛, ARG组细胞明显变圆、稀疏. 经ARG处理后, SMMC-7721细胞体外侵袭由Matrigel胶模拟的基底膜的能力受到明显抑制. 0、1.0、1.5、2.0 mg/L ARG组作用24 h后SMMC-7721细胞穿过基底膜的细胞数逐渐减少(图1), 差异除2组、3组之间外均有统计学意义(均P<0.01), 各药物组侵袭抑制率分别是41.25%, 51.43%, 68.18%. 上述各药物组作用SMMC-7721细胞8 h后穿过小孔的转移细胞数均明显减少(图1), 差异均有统计学意义(均P<0.01), 转移抑制率分别是32.55%、42.38%和59.31%.

图1 SMMC-7721细胞迁移和细胞侵袭(结晶紫染色×400). A: SMMC-7721细胞空白对照组; B: 牛蒡子苷元处理(1 mg/L, 8 h)之后的细胞迁移表现; C: 空白对照组; D: 牛蒡子苷元处理(1 mg/L, 24 h)之后的细胞(药物组)侵袭表现, 较空白对照组明显减少.

表3 不同浓度ARG对SMMC-7721细胞侵袭、转移的影响 (n, mean±SD).

分组	0 mg/L	1.0 mg/L	1.5 mg/L	2.0 mg/L
侵袭组	48±5	32±3a	25±2ac	19±2ac
转移组	112±10	76±7a	59±4ac	49±4ac

^aP<0.05 vs 空白对照组;

^cP<0.05 vs ARG 2.0 mg/L.

2.4 ARG对SMMC-7721细胞裸鼠肺转移灶的影响

药物组、阳性对照组、阴性对照组分别有5只、6只、8只裸鼠肺部出现转移灶, 阴性对照组肝脏发现转移灶, 其他脏器中均未发现可疑病灶. 将裸鼠肺脏取出, 在解剖显微镜下观察并记录肺转移灶数目和大小(图2), 并按以下标准分级: (+)级, 直径(d)<0.5 mm; (++)级, d = 0.5-1.0 mm; (+++)级, d = 1.1-2.0 mm; (++++)级, d>2.0 mm. 经秩和检验分析, 阴性组肺转移率(8/8 = 100%)高于阳性组(6/8 = 75%)和药物组(5/8 = 62.5%, P<0.05), 但后两者间无明显差异(P>0.05). 镜下可见: 裸鼠肺转移灶由大量密集排列的肝癌细胞构成, 在肺部小血管内可见瘤栓存在.

图2 肝癌SMMC-7721细胞裸鼠肺转移(HE染色×200).

3 讨论

侵袭和转移是恶性肿瘤最基本的特性[7], 是疾病进展、患者最终死亡的主要原因之一. Liotta[8]曾最早提出了侵袭、转移过程的"三步"假说: 黏附、降解与转移, 肿瘤细胞首先脱离原发灶, 黏附在基底膜与细胞外基质中的大分子蛋白, 并激活与基质蛋白溶解有关的蛋白水解酶如基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)等[9], 从而降解基底膜与细胞外基质[10], 肿瘤细胞运动穿过从而完成侵袭周围组织、完成血行、淋巴等转移[11], 肝癌细胞的黏附、侵袭和转移是肝癌发生转移, 甚或微转移[12]的重要步骤, 抑制肝癌细胞的黏附、侵袭和转移可能降低肝癌转移的发生.

本研究在体外主要利用培养基中重组形成与天然基质膜极为相似的Matrigel胶和聚碳酸酯膜制成人工膜, 观察到ARG对肿瘤细胞的黏附、侵袭和转移有显著的抑制作用: 可使SMMC-7721黏附能力明显下降, 且具有时间依赖性; 同时ARG可使细胞形态发生明显的改变, 有较强的抑制侵袭、转移能力. 提示ARG可降低肝癌SMMC-7721细胞黏附能力, 阻止侵袭、转移的发生. 在体内实验, 通过裸鼠尾静脉注射SMMC-7721细胞建立肺转移模型模拟肿瘤血行转移的自然进程, 然后观察ARG干预后转移性肿瘤生长情况, 发现ARG能抑制肿瘤的转移, 其效果与5-Fu相近.

ARG是一种细胞毒药物, 具有多种生物学活性, 可以影响肿瘤细胞的发生、发展的各个阶段, 既往对其促进肿瘤细胞的凋亡及相关信号通路有了一定的研究, 我们的前期研究中观察到ARG抑制肿瘤细胞增殖并诱导其凋亡[13,14]. 本实验结果表明: ARG在体外抑制肿瘤细胞的黏附、侵袭和转移, 在体内抑制肿瘤的转移. 目前分子靶向药物、中药单体成为肿瘤治疗热点[15-17], 与之类似的ARG相关分子机制有待于进一步实验研究, 从而为临床高效低毒抗肿瘤药物研制提出新的思路.

评论

背景资料

临床上牛蒡子复方制剂治疗感冒等感染性疾病, 以及多种肿瘤及白血病有显著效果, 其有效成分是牛蒡子苷元(ARG).

同行评议者

魏继福, 副研究员, 江苏省人民医院中心实验室

研发前沿

目前分子靶向药物、中药单体成为肿瘤治疗热点.

应用要点

ARG在体外抑制肿瘤细胞的黏附、侵袭和转移, 在体内抑制肿瘤的转移.

同行评价

本文研究系统, 具有一定的科学价值.

备注

编辑: 李薇 电编:李薇

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