NF-κB信号通路与炎症性肠病

摘要

炎症是多种细胞及细胞因子参与的机体防御性反应, 但严重或长期的炎症则会造成机体损伤. 炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)是一组以慢性、周期性炎症为特征的胃肠道疾病, 长期、反复的胃肠道炎症不仅影响患者生活质量, 而且增加了肠道纤维化及癌变的风险, 而核因子Kappa B(nuclear factor-kappa B, NF-κB)与炎症反应关系非常密切. 本文就NF-κB信号通路与IBD的联系作一简要概述.

关键词: 炎症性肠病; 核因子κB; 信号通路

NF-κB signaling pathway and inflammatory bowel disease

Shan-Jin Zhang, Bi-Min Li

Shan-Jin Zhang, Bi-Min Li, Department of Gastroenterology, the First Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang 330006, Jiangxi Province, China

Correspondence to: Associate Professor Bi-Min Li, Department of Gastroenterology, the First Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang 330006, Jiangxi Province, China. lbmjx@163.com

Received: November 24, 2010
Revised: January 17, 2011
Accepted: January 26, 2011
Published online: February 18, 2011

Abstract

Inflammation is a defensive reaction involving a variety of cells and cytokines. However, serious or long-term inflammation may cause impairment of organisms. Inflammatory bowel disease (IBD) is a group of gastrointestinal diseases characterized by chronic and periodic inflammation. Long-term, repeated gastrointestinal inflammation not only influences the quality of life of patients but also increases the risk of fibrosis and carcinoma in the intestinal tract. It has been demonstrated that nuclear factor-kappaB (NF-κB) signaling has a close relationship with inflammation. The aim of this paper is to discuss the relationship between NF-κB signaling pathway and IBD.

Key Words: Inflammatory bowel disease; Nuclear factor-kappa B; Signal pathway

0 引言

炎症性肠病包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)和克罗恩病(Crohn's, CD), 是一组病因及发病机制尚不十分清楚的胃肠道慢性炎症性疾病, 目前认为与遗传、环境及免疫等因素有关. NF-κB在调控炎症反应起非常重要的作用, 如果能在NF-κB信号通路基础上寻找新的药物, 那么就有可能打破现有药物的局限性, 减少传统药物的不良反应, 提高患者的生活质量.

1 NF-κB的活化

1.1 NF-κB结构

NF-κB最初是由Sen和Baltimore等发现的一种能与免疫球蛋白κ链基因的增强子κB序列特异结合的核蛋白, 由5个亚单位组成: NF-κB1(P50), NF-κB2(P52), RelA(P65), RelB和c-Rel, 其中P50和P52是没有激活结构域[1]. 他们以同源或异源二聚体的形式存在, 其中以P50/ RelA最为常见[2], NF-κB蛋白共同拥有大约为300个氨基酸Rel的同源结构域, 此区域负责与DNA结合、二聚体化和核定位. 通常NF-κB与其抑蛋白IκB结合形成无活性的复合物存在于细胞质中, 当IκB发生磷酸化和泛素化进而被蛋白酶体降解时, 游离的NF-κB转入细胞核内, 与DNA结合, 调控其目的基因的转录[3]. NF-κB参与调节各种生理和病理过程, 如炎症、天然和获得免疫应答以及细胞细胞存活[4].

1.2 NF-κB抑制蛋白

目前已发现5种蛋白可以抑制NF-κB的活化, 其中包括3种NF-κB抑制因子: IκBα, IκBβ和IκBε及2种NF-κB前体蛋白P105和P100, 所有的抑制蛋白都拥有与NF-κB结合的锚蛋白重复序列结构域(ARD)[5], 其中几种蛋白的氨基末端调节区有被IκB激酶(IκB kinase, IKK)磷酸化位点, 羧基末端含有PEST降解序列. IκBα囊括了IκBβ和IκBε的抑制功能, 并且通常是与P50/RelA结合[6]. 游离的IκBα的热力学稳定性是非常低的, 并且很快地被蛋白酶体降解, 这一过程不需要发生磷酸化和泛素化[7], 最近有研究表明IκBα快速的合成和降解为对抗代谢性应激提供了一种机制.

1.3 IKK、IKK复合物

包括两种激酶亚基IKKα、IKKβ, 以及一种调节亚基NEMO(IKKγ). 当NEMO发生泛素化并且至少一种IKK激酶磷酸化时IKK才能被激活, 活化的IKK使IκB发生磷酸化并降解, 从而激激活NF-κB.

1.4 NF-κB两条重要信号通路

许多种受体与配体结合可以使NF-κB活化, 但对于认识NF-κB激活信号研究最多的是肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factor receptor, TNFR)家庭和Toll/IL-1受体(Toll/interleukin-1 receptor, TIR)家族[6], 后者由Toll受体(Toll-like receptors, TLRs)和白介素-1受体(interleukin-1 receptors, IL-1Rs)构成.

1.4.1 TNF通路: TNFR家族由TNFR1(P55)和TNFR2(P75)两型组成. 当TNF与TNFR相互作用后, 受体发生三聚体化, 并招集TNFR相关死亡结构域蛋白(TNFR1-associated death domain protein, TRADD)形成TNFR-TRADD复合物, 在经典的NF-κB信号通路中, TNFR-TRADD复合物招集TNFR相关因子2(TNFR-associated factor 2, TRAF)和受体相关蛋白(receptor-interacting protein, RIP), TRAF可以使RIP泛素化. RIP是此信号通路的关键接头蛋白, 共有7个成员, 他们都有保守的丝氨酸/苏氨酸激酶区域, 他通过与IKK的NEMO亚基结合使IKK集聚于TNFR复合物, 从而活化IKK, 启动NF-κB信号通路.

1.4.2 TLRs通: TLRs与核苷酸寡聚化结构域(nucleotide oligomerization domain, NOD)同属于模式受体(pattern recognition receptors, PPRs)家族, 不同的是TLRs位于细胞外, 而NOD则位于细胞质. TLRs由胞膜外区, 胞质区和跨膜区组成, 且均为Ⅰ型跨膜蛋白, 因其胞内段与人IL-1R胞质区同源, 故称为TIR结构域. 到目前为止, 已发现人类至少有11种TLRs, 而鼠类有13种, 他们主要表达于抗原加工和提逞细胞, 如巨噬细胞、中性粒细胞及树突状细胞(dendritic cells, DCs), 另外, 不同的TLR可以组合在一起. TLRs可以识别包括病原相关分子模式(pathogen associated molecular patterns, PAMPs)在内的配体, 是衔接天然免疫和获得性免疫的桥梁, 在机体天然免疫对病原体的识别起重要作用.

当TLR与配体结合时, 本身发生多聚体化, 然后TIR结构域集聚衔接蛋白MYD88、TRIF、TIRAP. MYD88与白介素-1受体相关激酶(IL-1 receptor associated kinase, IRAK-1)相互作用, 后者属于丝/苏氨酸蛋白激酶(serine/threonine activated kinase), 使IRAK-4磷酸化IRAK-1, 激发IRAK-1发生自身磷酸化, 磷酸化的IRAK-1从受体复合中分离出来, 并且结合于肿瘤坏死因子受体相关因子-6(TRAF6), IRAK-1/TRAF6复合物活化转化生长因子β激活性激酶(transforming growth factor β activated kinase 1, TAK1)/转化生长因子β激活性激酶结合蛋白(TAK1-binding protein 1, TAB1)复合物, 后者可以激活IKK.

2 IBD与可能的致病因素

2.1 IBD与遗传

许多流行病学资料认为遗传因素与IBD的关系十分密切, 例如有5%-20%的IBD患者有IBD家族史, 并且同卵双生子IBD的发病率明显比双卵双生子要高[8], 更有力的证据就是NOD2/CARD15基因于2001年被证实与CD的易感性有关[9]. NOD2表达于肠上皮细胞(也包括潘氏细胞和单核细胞), 他可以识别胞壁酰二肽(MDP)等抗原, 使IKK的调节亚基NEMO泛素化, 进而活化NF-κB[10,11]. 也有研究表明位于IBD3的TNF-α相关基因的启动子区序列-308G/A单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)会增加UC的风险性[12]. 此外, 全基因组关联研究(GWAS)发现了一系列的IBD易感基因座, 如IL23R[13]、STAT3、JAK2、IL-23[14], 这些基因座与CD和/或UC联系紧密[15].

2.2 IBD与环境

IBD好发于工业化国家, 在北美, UC的发病率为2.2-14.3/100 000人年数, CD为3.1-14.6/100 000人年数, 近年来低发病率的地区如日本、南韩、新加坡、拉丁美洲IBD也在上升[16], 而在同卵双生子中IBD的发病率也低于100%[8], 这些都说明了环境因素影响IBD的发生和发展. 此外吸烟、饮食、阑尾切除术、职业等因素与IBD有关.

2.3 IBD与免疫

20世纪50年代末, 60年代初, UC患者结肠上皮细胞自身抗体的发现指示免疫因素在IBD的发病机制中占非常重要的地位[17]. 一般认为CD是IL-12介导的Th1型反应而UC是Th2型, 但也有研究表明在肠道慢性炎症起重要作用的是由IL-12p40和IL-23p19两个亚基构成IL-23, 而不是IL-12, 从而使我们必须重新评估IL-12和IL-23在各种炎症性疾病的作用[18]. 肠道天然免疫和获得性免疫对肠腔内微生物免疫应答的紊乱认为参与了IBD的发病机制[19], 而肠道对抗原的免疫反应受肠上皮细胞和肠树状细胞的控制[20].

2.3.1 肠上皮细胞: 肠上皮细胞参与了肠道屏障的结构, 他可以阻止外来抗原与固有层上的免疫细胞接触, 而肠上皮的屏障功能的破坏可能是IBD发病机制中重要的机制[21], 有研究发现炎症性肠病患者肠上皮细胞缺乏对抑制性T细胞诱导[22]. 当肠上皮细胞表面TLR识别特定的微生物相关分子模式时, TLR则通过激活NF-κB引发炎症, 一旦炎症发生, 肠上皮细胞胞质中NOD的表达也会增加[20], 此外其可以分泌抗微生物肽而在天然的宿主防御中起很重要作用[23].

2.3.2 肠DCs: DCs是体内功能最强的专职抗原递呈细胞, 在天然免疫和获得性免疫之间扮演着"信使"的角色. DCs通过与调节T淋巴细胞和效应T淋巴细胞相互作用从而达到对肠道内自身抗原、食物抗原以及肠道内共生菌的耐受[24]. DCs主要分布于Peyer's淋巴结(Peyer's patches, PPs)、肠系膜淋巴结(mesenteric lymph nodes, MLN)以及固有层, 就功能而言, DCs分为非成熟型和成熟型, 前者存在于外周组织, 起吞噬作用, 即抗原采集, 后者存在于淋巴器官, 起抗原递呈, 在炎症的刺激下非成熟型DCs从外周迁移于淋巴结, 事实上迁移是其成熟的过程[25]. 肠道内的DCs一般通过如下途径摄取肠腔内的抗原: 第一, 固有层的DCs直接从上皮细胞间伸出轴突摄取抗原; 第二, 通过PP顶部的M细胞传递给PPs内的DCs. DCs是通过PRRs来提取抗原的, 在CD, 肠道的DCs高表达TLR2和TLR4[26]. 成熟的DCs与T淋巴细胞相互作用后使T淋巴细胞分化成各种功能的细胞, 此外, 其自身可以分泌Th1特征的细胞因子IL-12、IL-23、IL-18以及Th2特征的细胞因子IL-4[27].

2.3.3 肠道内微生物: 肠道内至少有400种细菌, 这些微生物影响着黏膜结构、功能及其免疫系统的发育[28], 而且其代谢产物如维生素K、叶酸盐和短链脂肪酸是肠道丰富的营养物质. 无菌状态下实验性小鼠动物模型不会发生结肠炎以及口服抗菌药可以缓解IBD患者的症状表明细菌参与了IBD发病[29,30].

3 目前IBD的生物治疗

药物仍是IBD治疗的主要手段, 传统药物如氨基水杨酸类、糖皮质激素、抗菌素、免疫抑制剂等仍占据主导作用, 而他们给患者带来的各种副作用和并发症目前还是得不能解决[31]. 近年来随着生物制剂的崛起, 药物治疗在过去的十年得到巨大的发展, 抗TNF制剂如英夫利昔单抗(infliximab)、阿达木(adalimuma)、聚乙二醇化西他丽珠(certolizumab)早已应用于临床治疗CD, 只有英夫利昔单抗最近才用于治疗UC[32]. 此外, 重组人细胞因子、生长因子、抗T淋巴细胞制剂、Th1细胞极化抑制剂、抗IL-6受体抗体制剂等目前也在临床上使用, 但都存在较多的不良反应, 而益生菌通过拮抗IBD患者肠道内致病菌的生长, 改善菌群失调, 达到保护肠道微生态和肠道屏障功能, 且无明显副作用. 当然人们也越来越关注生物制剂存在的安全性的问题, 如抗TNF药物会增加肺结核感染[33]、出现局部注射反应以及可能会导致非霍奇金淋巴瘤的发生[34]等, 但我们应该利用好生物制剂这把双刃剑, 并创造出作用部位局限、全身反应小的生物药品.

4 NF-κB与肠道慢性炎症

当脂多糖、肽聚糖、脂磷壁酸、胞壁酰二肽等抗原与肠道抗原提逞细胞PPRs(TLRs、NOD等)相结合, 一方面激活NF-κB信号通路, 自身分泌细胞因子, 另一方面则启动肠道获得性免疫, 被激活的免疫细胞产生白介素、肿瘤坏死因子、干扰素等炎症因子, 而这些炎症因子又可以反作用于NF-κB信号通路, 使更多的NF-κB蛋白转移到核内, 调控多种炎症因子相关基因的表达, 进一步加重肠道炎症反应, 所以如果能阻止NF-κB信号通路的开放, 就可能有效地控制肠道炎症. 目前主要治疗IBD的药物如氨基水杨酸类、糖皮质激素的作用机制也与NF-κB相关[35,36], 而TNF-α单克隆抗体(英夫利昔单抗)则直接阻止TNF-α与受体合, 大大减少了NF-κB信号的放大. 此外环孢A素、中药(如姜黄)、L-肌肽锌等也能抑制NF-κB的活性, 而NF-κB反义寡核苷酸更是可能成为将来治疗IBD的主要药物.

5 结论

NF-κB信号通路是非常复杂的, 而其与IBD肠道炎症的关系密切, 如果能够开发出靶向性更强、毒性更小的, 更为有效地阻止NF-κB的核转移或是其与核内DNA结合的药物, 这样不仅可以更有效地缓解IBD患者的症状, 而且可以大大减少药物的不良反应, 进一步改善患者的生活质量.

评论

背景资料

炎症性肠病是一组以慢性、反复发作为特征的肠道炎症性疾病, 本病主要以欧美多见, 但我国的发病率呈逐年上升趋势. 该病病因及发病机制尚不明确, 内科治疗主要以控制活动期及诱导和维持缓解期为目的, 不仅无法治愈本病, 且效果不佳. 近年来大量基础研究表明NF-κB信号通路与肠道炎症关系密切, 如以此信号通路为基础研究, 有望开发出效果更好的新型药物, 打破现有传统药物的僵局, 甚至可以明确该病的发病机制.

同行评议者

陈其奎, 教授, 中山大学附属第二医院消化内科

相关报道

Stefan等研究发现NF-κB反义寡核苷酸可以有效地阻止三硝基苯磺酸诱导实验性结肠炎小鼠肠道由Th1或Th2介导的炎症的发生, 减轻小鼠肠道的炎症反应.

创新盘点

信号通路是非常复杂的, 目前对炎症性肠病的认识也不够充分, 而本文把NF-κB信号通和IBD有机地联系在一起, 并为新的治疗炎症性肠病药物如NF-κB反义寡核苷酸、NF-κB抑制剂等临床研发提供了一定的方向.

同行评价

本文科学性和可读性较好, 具有较好的理论价值.

备注

编辑:曹丽鸥 电编:何基才

参考文献

1.	Driessler F, Venstrom K, Sabat R, Asadullah K, Schottelius AJ. Molecular mechanisms of interleukin-10-mediated inhibition of NF-kappaB activity: a role for p50. Clin Exp Immunol. 2004;135:64-73.  [PubMed]  [DOI]

2.	Visekruna A, Joeris T, Seidel D, Kroesen A, Loddenkemper C, Zeitz M, Kaufmann SH, Schmidt-Ullrich R, Steinhoff U. Proteasome-mediated degradation of IkappaBalpha and processing of p105 in Crohn disease and ulcerative colitis. J Clin Invest. 2006;116:3195-3203.  [PubMed]  [DOI]

3.	Bergqvist S, Ghosh G, Komives EA. The IkappaBalpha/NF-kappaB complex has two hot spots, one at either end of the interface. Protein Sci. 2008;17:2051-2058.  [PubMed]  [DOI]

4.	Marienfeld RB, Palkowitsch L, Ghosh S. Dimerization of the I kappa B kinase-binding domain of NEMO is required for tumor necrosis factor alpha-induced NF-kappa B activity. Mol Cell Biol. 2006;26:9209-9219.  [PubMed]  [DOI]

5.	Basak S, Hoffmann A. Crosstalk via the NF-kappaB signaling system. Cytokine Growth Factor Rev. 2008;19:187-197.  [PubMed]  [DOI]

6.	Leeman JR, Gilmore TD. Alternative splicing in the NF-kappaB signaling pathway. Gene. 2008;423:97-107.  [PubMed]  [DOI]

7.	Truhlar SM, Mathes E, Cervantes CF, Ghosh G, Komives EA. Pre-folding IkappaBalpha alters control of NF-kappaB signaling. J Mol Biol. 2008;380:67-82.  [PubMed]  [DOI]

8.	Cho JH. Inflammatory bowel disease: genetic and epidemiologic considerations. World J Gastroenterol. 2008;14:338-347.  [PubMed]  [DOI]

9.	Walters TD, Silverberg MS. Genetics of inflammatory bowel disease: current status and future directions. Can J Gastroenterol. 2006;20:633-639.  [PubMed]  [DOI]

10.	Abbott DW, Yang Y, Hutti JE, Madhavarapu S, Kelliher MA, Cantley LC. Coordinated regulation of Toll-like receptor and NOD2 signaling by K63-linked polyubiquitin chains. Mol Cell Biol. 2007;27:6012-6025.  [PubMed]  [DOI]

11.	Barnich N, Aguirre JE, Reinecker HC, Xavier R, Podolsky DK. Membrane recruitment of NOD2 in intestinal epithelial cells is essential for nuclear factor-{kappa}B activation in muramyl dipeptide recognition. J Cell Biol. 2005;170:21-26.  [PubMed]  [DOI]

12.	Ferguson LR, Huebner C, Petermann I, Gearry RB, Barclay ML, Demmers P, McCulloch A, Han DY. Single nucleotide polymorphism in the tumor necrosis factor-alpha gene affects inflammatory bowel diseases risk. World J Gastroenterol. 2008;14:4652-4661.  [PubMed]  [DOI]

13.

Zhernakova A, Festen EM, Franke L, Trynka G, van Diemen CC, Monsuur AJ, Bevova M, Nijmeijer RM, van 't Slot R, Heijmans R. Genetic analysis of innate immunity in Crohn's disease and ulcerative colitis identifies two susceptibility loci harboring CARD9 and IL18RAP. Am J Hum Genet. 2008;82:1202-1210.  [PubMed]  [DOI]

14.

Sato K, Shiota M, Fukuda S, Iwamoto E, Machida H, Inamine T, Kondo S, Yanagihara K, Isomoto H, Mizuta Y. Strong evidence of a combination polymorphism of the tyrosine kinase 2 gene and the signal transducer and activator of transcription 3 gene as a DNA-based biomarker for susceptibility to Crohn's disease in the Japanese population. J Clin Immunol. 2009;29:815-825.  [PubMed]  [DOI]

15.	Mikhailov TA, Furner SE. Breastfeeding and genetic factors in the etiology of inflammatory bowel disease in children. World J Gastroenterol. 2009;15:270-279.  [PubMed]  [DOI]

16.	Loftus EV Jr. Clinical epidemiology of inflammatory bowel disease: Incidence, prevalence, and environmental influences. Gastroenterology. 2004;126:1504-1517.  [PubMed]  [DOI]

17.	Wen Z, Fiocchi C. Inflammatory bowel disease: autoimmune or immune-mediated pathogenesis? Clin Dev Immunol. 2004;11:195-204.  [PubMed]  [DOI]

18.	Hue S, Ahern P, Buonocore S, Kullberg MC, Cua DJ, McKenzie BS, Powrie F, Maloy KJ. Interleukin-23 drives innate and T cell-mediated intestinal inflammation. J Exp Med. 2006;203:2473-2483.  [PubMed]  [DOI]

19.

Frolova L, Drastich P, Rossmann P, Klimesova K, Tlaskalova-Hogenova H. Expression of Toll-like receptor 2 (TLR2), TLR4, and CD14 in biopsy samples of patients with inflammatory bowel diseases: upregulated expression of TLR2 in terminal ileum of patients with ulcerative colitis. J Histochem Cytochem. 2008;56:267-274.  [PubMed]  [DOI]

20.	Baumgart DC, Carding SR. Inflammatory bowel disease: cause and immunobiology. Lancet. 2007;369:1627-1640.  [PubMed]  [DOI]

21.	Canny GO, McCormick BA. Bacteria in the intestine, helpful residents or enemies from within? Infect Immun. 2008;76:3360-3373.  [PubMed]  [DOI]

22.	Mayer L, Eisenhardt D. Lack of induction of suppressor T cells by intestinal epithelial cells from patients with inflammatory bowel disease. J Clin Invest. 1990;86:1255-1260.  [PubMed]  [DOI]

23.	Mueller C, Macpherson AJ. Layers of mutualism with commensal bacteria protect us from intestinal inflammation. Gut. 2006;55:276-284.  [PubMed]  [DOI]

24.	Niess JH. Role of mucosal dendritic cells in inflammatory bowel disease. World J Gastroenterol. 2008;14:5138-5148.  [PubMed]  [DOI]

25.	Rescigno M, Di Sabatino A. Dendritic cells in intestinal homeostasis and disease. J Clin Invest. 2009;119:2441-2450.  [PubMed]  [DOI]

26.	Coombes JL, Powrie F. Dendritic cells in intestinal immune regulation. Nat Rev Immunol. 2008;8:435-446.  [PubMed]  [DOI]

27.	Stagg AJ, Hart AL, Knight SC, Kamm MA. The dendritic cell: its role in intestinal inflammation and relationship with gut bacteria. Gut. 2003;52:1522-1529.  [PubMed]  [DOI]

28.	Bai AP, Ouyang Q. Probiotics and inflammatory bowel diseases. Postgrad Med J. 2006;82:376-382.  [PubMed]  [DOI]

29.	Levin A, Shibolet O. Toll-like receptors in inflammatory bowel disease-stepping into uncharted territory. World J Gastroenterol. 2008;14:5149-5153.  [PubMed]  [DOI]

30.	Himmel ME, Hardenberg G, Piccirillo CA, Steiner TS, Levings MK. The role of T-regulatory cells and Toll-like receptors in the pathogenesis of human inflammatory bowel disease. Immunology. 2008;125:145-153.  [PubMed]  [DOI]

31.	Engel MA, Neurath MF. New pathophysiological insights and modern treatment of IBD. J Gastroenterol. 2010;45:571-583.  [PubMed]  [DOI]

32.	Harris A, Feller ER, Shah SA. Medical therapy of IBD in 2009. Med Health R I. 2009;92:78-81.  [PubMed]  [DOI]

33.	Keane J, Gershon S, Wise RP, Mirabile-Levens E, Kasznica J, Schwieterman WD, Siegel JN, Braun MM. Tuberculosis associated with infliximab, a tumor necrosis factor alpha-neutralizing agent. N Engl J Med. 2001;345:1098-1104.  [PubMed]  [DOI]

34.	D'Haens G. Risks and benefits of biologic therapy for inflammatory bowel diseases. Gut. 2007;56:725-732.  [PubMed]  [DOI]

35.	Bantel H, Berg C, Vieth M, Stolte M, Kruis W, Schulze-Osthoff K. Mesalazine inhibits activation of transcription factor NF-kappaB in inflamed mucosa of patients with ulcerative colitis. Am J Gastroenterol. 2000;95:3452-3457.  [PubMed]  [DOI]

36.	甘 华田, 欧阳 钦, 陈 友琴. 核因子-κB p65反义寡核苷酸对溃疡性结肠炎肠黏膜单个核细胞细胞因子表达的影响. 生物医学工程杂志. 2003;20:268-272.  [PubMed]  [DOI]