基础研究 Open Access
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世界华人消化杂志. 2011-10-08; 19(28): 2925-2930
在线出版日期: 2011-10-08. doi: 10.11569/wcjd.v19.i28.2925
KDR单克隆抗体对荷人胃癌裸小鼠肿瘤生长的抑制作用
孔桂美, 张小荣, 吴克艳, 赵飞燕, 朱海杭, 张旭东, 廖月霞, 卜平
孔桂美, 卜平, 扬州大学临床医学院 江苏省扬州市 225001
张小荣, 吴克艳, 赵飞燕, 廖月霞, 扬州大学 江苏省扬州市 225001
朱海杭, 张旭东, 扬州大学临床医学院 江苏省扬州市 225001
孔桂美, 讲师, 主要从事抗胃癌新药方面的研究.
基金项目: 国家自然科学基金资助项目, No. 30801497.
作者贡献分布: 孔桂美与张小荣对此文所作贡献均等; 此课题由孔桂美、张小荣及卜平设计, 研究过程由吴克艳、赵飞燕及廖月霞操作完成; 研究所用试剂及分析工具由孔桂美、朱海杭及卜平提供; 数据分析由孔桂美、张小荣及张旭东完成; 本论文写作由孔桂美与张小荣完成.
通讯作者: 卜平, 教授, 主任医师, 225001, 江苏省扬州市淮海路11号, 扬州大学临床医学院. yzuboping@163. com
电话: 0514-87978801
收稿日期: 2011-07-31
修回日期: 2011-09-03
接受日期: 2011-10-02
在线出版日期: 2011-10-08

目的: 研究血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)受体Ⅱ单克隆抗体(KDR-mAb)抑制荷人胃癌裸小鼠肿瘤生长的作用.

方法: 将人胃癌细胞(SGC-7901)通过背部皮下接种裸小鼠制备荷人胃癌小鼠肿瘤模型. 待肿瘤生长至直径100-300 mm3时将荷瘤小鼠随机分为3组, 分别腹腔注射KDR-mAb、5-FU和生理盐水进行治疗. 10 d后剥离瘤组织, 比较3组肿瘤组织的体积和质量、计算抑瘤率; 通过Real-time PCR法和免疫组织化学法分别定量检测VEGF在各治疗组肿瘤组织中的表达.

结果: KDR-mAb在体内能显著抑制实体瘤的生长, 抑瘤率为36.3%, 肿瘤大小和肿瘤质量与对照组比较差异显著(1889.94 mm3± 396.64 mm3vs 9398.34 mm3± 7413.96 mm3, 1.07 g± 0.58 g vs 1.68 g± 0.18 g, 均P<0.05); KDR-mAb能显著抑制肿瘤组织中VEGF mRNA和VEGF蛋白的表达(P<0.05).

结论: 作为VEGF受体抑制剂, KDR-mAb在荷人胃癌细胞小鼠肿瘤模型中具有明显的体内抗肿瘤活性, 对于人胃癌的临床治疗具有一定的应用前景.

关键词: 血管内皮细胞生长因子受体Ⅱ; 单克隆抗体; 胃癌; 抗肿瘤活性
引文著录: 孔桂美, 张小荣, 吴克艳, 赵飞燕, 朱海杭, 张旭东, 廖月霞, 卜平. KDR单克隆抗体对荷人胃癌裸小鼠肿瘤生长的抑制作用. 世界华人消化杂志 2011; 19(28): 2925-2930
Inhibitory effect of KDR-specific monoclonal antibody on tumor growth in nude mice bearing human gastric cancer
Gui-Mei Kong, Xiao-Rong Zhang, Ke-Yan Wu, Fei-Yan Zhao, Hai-Hang Zhu, Xu-Dong Zhang, Yue-Xia Liao, Ping Bo
Gui-Mei Kong, Ping Bo, Clinical Medical School of Yangzhou University, Yangzhou 225001, Jiangsu Province, China
Xiao-Rong Zhang, Ke-Yan Wu, Fei-Yan Zhao, Yue-Xia Liao, Yangzhou University, Yangzhou 225001, Jiangsu Province, China
Hai-Hang Zhu, Xu-Dong Zhang, Clinical Medical School of Yangzhou University, Yangzhou 225001, Jiangsu Province, China
Supported by: the National Natural Science Foundation of China, No. 30801497.
Correspondence to: Ping Bo, Professor, Clinical Medical School of Yangzhou University, Yangzhou 225001, Jiangsu Province, China. yzuboping@163. com
Received: July 31, 2011
Revised: September 3, 2011
Accepted: October 2, 2011
Published online: October 8, 2011

AIM: To evaluate the anti-cancer activity of monoclonal antibody (mA) against vascular endothelial growth factor (VEGF) receptor II (KDR) in nude mice bearing human gastric cancer.

METHODS: BALB/c nude mice were subcutaneously inoculated with human gastric cancer cells (SGC-7901) to develop a xenograft model of human gastric cancer. When tumor volume reached 100-300 mm3, all mice were randomly divided into three groups and intraperitoneally injected with KDR-mAb, 5-FU and physiological saline, respectively. Ten days after injection, all tumors were removed, measured, and weighted. The reduced rate of tumor growth was calculated. VEGF expression was quantified by real-time polymerase chain reaction (PCR) and immunohistochemistry.

RESULTS: KDR-mAb inhibited the growth of solid tumors compared to the two control groups (1889.94 mm3 ± 396.64 mm3vs 9398.34 mm3± 7413.96 mm3, 1.07 g± 0.58 g vs 1.68 g± 0.18 g, both P < 0. 05), and the reduced rate of tumor growth was up to 36. 3%. VEGF expression was significantly inhibited in tumors in the KDR-mAb treated group (P < 0. 05).

CONCLUSION: KDR-mAb can inhibit the growth of solid tumors in a mouse xenograft model of gastric cancer and may be used for clinical treatment of human gastric cancer.

Key Words: Vascular endothelial growth factor receptor II; Monoclonal antibody; Gastric cancer; Anti-cancer activity
0 引言

胃癌是常见的恶性肿瘤之一, 世界范围内胃癌位居肿瘤死亡的第2位[1]. 在我国, 胃癌死亡率占所有恶性肿瘤死亡的23%, 居各类癌症死亡的第1位[2]. 血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)及其受体(Flt-1、KDR)的过度表达与肿瘤的生长、侵袭及转移密切相关[3-5]. 其中KDR是促进血管内皮细胞有丝分裂、增殖、迁移、分化、微管形成等生命活动的关键介导物, 阻断VEGF-KDR途径可以明显抑制新生血管生成达到抑制肿瘤的目的[6]. KDR胞外7个Ig-样结构域对配体和受体的作用不同, 有研究报道[7-11], 针对胞外l-3区、5-7区和3区的相关片段的表达, 均抑制VEGF的活性. 本研究通过研究KDR胞外3区的mAb在荷瘤小鼠模型体内的抗肿瘤活性, 探讨KDR在抗胃癌研究中的作用, 为胃癌的防治提供新的治疗思路.

1 材料和方法
1.1 材料

KDR-mAb由本实验室自行研制[12]; 5-FU购自上海旭东海普药业有限公司. 胎牛血清(FCS)购自Hyclone公司; 小牛血清(NCS)、PPMI 1640购自Gibco公司; 人胃腺癌细胞株(SGC-7901)由本室保存; 重组人VEGF165购自R&D公司; 商品化KDR单克隆抗体Flk(A-3)购自Santa Cruz生物公司; SYBR Green PCR Master Mix(2×)购自ABI公司; 第一链cDNA合成试剂盒(AMV First Strand cDNA Synthesis Kit)购自BBI公司; 4-6周龄SPF级BALB/c-nu裸小鼠(18 g±2 g)购自江苏省比较医学中心; 兔抗人VEGF多克隆抗体, DAB显色试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司.

1.2 方法

1.2.1 KDR在SGC-7901细胞中的表达鉴定: (1)SGC-7901 KDR表达的诱导. 将长成单层的SGC-7901细胞用2.5 g/L的胰酶消化后, 用含10%小牛血清的PPMI 1640培养液调整至合适的浓度, 按1×105细胞/孔接种于加有盖玻片的6孔细胞培养板, 于37 ℃、50 mL/L CO2温箱培养至50%-60%, 按8 ng/孔加入重组人VEGF165诱导16 h; (2)细胞免疫组织化学. 按照文献方法[13]将诱导后的SGC-7901细胞用950 mL/L乙醇固定15 min, 室温吹干, PBS洗3次, 每次2 min, 用0.5% Triton X-100和3% H2O2处理后, 依次用1% BSA室温孵育20 min, 1:200稀释的鼠抗人KDR-mAb, 37 ℃作用1 h, 和1:200稀释的羊抗鼠HRP-IgG, 37 ℃作用30 min. 用新鲜配制的DAB显色, 光镜下观察, 蒸馏水终止反应, 苏木精衬染, 晾干后中性树胶封片. 同时设立不加一抗的阴性对照.

1.2.2 mAb抑制荷瘤裸鼠胃癌生长: (1)裸鼠饲养. 将30只BALB/C-nu裸小鼠(雌雄各半)饲养于SPF级小鼠负压隔离器中, 自由饮水和采食[14]; (2)动物造模. 取对数期SGC-7901细胞用0.25%的胰酶消化制备细胞悬液, 调整细胞浓度为1×108/mL; 用1 mL注射器在每只裸鼠背部皮下注射细胞悬液0.1 mL注射后轻压5 s; 将小鼠重新放回笼中观察3-5 d, 以背部皮下出现米粒大小质硬的结节作为造模成功标准[15]; (3)肿瘤抑制实验. 选取造模成功的裸小鼠, 选取体积达到100-300 mm3的裸小鼠进行实验, 随机分为阴性对照组(生理盐水, NS)、阳性对照组(5-FU)、KDR-mAb治疗组3组, 每组6只, 雌雄各半, 治疗时间为10 d. NS组每天腹腔注射生理盐水0.1 mL; 5-FU组每天腹腔注射20 mg/kg 5-FU; mAb治疗组按1 µg/只剂量每天腹腔注射KDR mAb. 治疗10 d后, 处死小鼠, 分离皮下瘤组织, 测量瘤组织的纵径(a)和横径(b), 根据公式计算体积, 肿瘤体积(tumor volume, TV)的计算公式: TV = 1/2ab2. 计算肿瘤抑制率, 肿瘤肿瘤抑制率(%) = (1-治疗组平均瘤质量G1/对照组平均瘤质量G0)×100%[16]. (4)荧光定量PCR检测肿瘤组织中VEGF的表达. 肿瘤组织标本采集后迅速放至液氮中冷冻, 然后转入-80 ℃保存备用[17]. 使用TRIZOL试剂提取肿瘤组织总RNA, 然后检测吸光度(A)值, 所提取的RNA纯度A260/A280均在1.8以上. 按照逆转录试剂盒说明书, 将总RNA逆转录成cDNA, 以GAPDH为内参照进行Real-time PCR. 引物的设计与合成: 参照GenBank中的基因序列, 使用Primer Premier 5.0进行设计. GAPDH引物序列: GAPDH上游引物F: 5'-GTGGTCTCCTCTGACTTCAACA-3'; 下游引物R: 5'-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3', 扩增片段为136 bp; VEGF引物序列: VEGF上游引物F: 5'-CCCACTGAGGAGTCCAACAT-3', VEGF下游引物R: 5'-ACAGGGATTTTCTTGTCTTGC-3', 扩增片段为144 bp. 上述引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成; PCR反应: 反应体系为20 µL, SYBR Green PCR Master Mix(2×) 10 µL, 10 µmol/L上下游引物各1 µL, 双蒸水7 µL, cDNA 1 µL. 反应条件: 95 ℃变性10 min, 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 1 min, 共40个循环, 扩增完毕后, 进行溶解曲线分析[18], 每个标本均作复管; (3)PCR产物定量的校正和判定分析: 采用GAPDH作为内参照. VEGF mRNA和GAPDH mRNA根据标准曲线得出mRNA的分子拷贝数. 用GAPDH的拷贝数作为校正基数, 即目的基因mRNA精确含量 = 目的基因Ct值/内参照GAPDH Ct值, 以此比值作统计处理; (4)免疫组织化学检测肿瘤组织中VEGF的表达. 取部分瘤组织和其他脏器用40 g/L甲醛溶液固定24 h, 蒸馏水浸泡2 h, 常规梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋, 切片, 厚4 μm, 贴于多聚赖氨酸处理的载玻片上, 4 ℃保存备用[19]. 按照文献方法[20]进行免疫组织化学, DAB显色, 光镜下观察胞质或胞核有棕色颗粒者为阳性细胞. 阴性对照不加一抗, 用0.01 mol/L PBS代替, 随机挑选4个视野, 计算表达VEGF阳性细胞数.

统计学处理 实验数据均以mean±SD表示, 应用SPSS13.0进行统计分析, 组内差异比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA), 比较各组间的差别有无显著性意义, 以P<0.05为有显著性差异.

2 结果
2.1 VEGF诱导SGC-7901细胞的细胞免疫组织化学结果

阴性对照组细胞无明显染色, KDR-mAb和Flk(A-3)处理细胞组, 几乎所有细胞胞浆和胞膜上都有深黄色颗粒, 说明SGC-7901细胞经VEGF诱导后, 能大量表达KDR(图1).

图1
图1 胃腺癌细胞(SGC-7901)胞浆和胞膜上表达KDR. A: 阴性对照组; B: KDR单抗作用组; C: 阳性抗体Flk(A-3)组.
2.2 荷瘤小鼠KDR mAb治疗结果

治疗期间, 阴性对照组, 小鼠精神状态较好, 小鼠肿瘤较大; KDR mAb治疗组小鼠在治疗期间, 精神状态较好, 肿瘤形成较小(图2). 治疗前各组小鼠体质量差异比较差异不显著(表1), 治疗后体质量与对照组相比差异不显著(表1), 但肿瘤体积与对照组相比差异显著(P<0.05, 表2), 肿瘤质量与对照组相比差异显著(P<0.05, 表2), 肿瘤抑制率为36.3%; 5-FU治疗组小鼠, 肿瘤形成较小(图2), 肿瘤抑制率为49.4%, 但由于化疗药对普通细胞也有一定的杀伤性, 小鼠在治疗期间, 精神状态比较萎靡, 吃食饮水量明显下降, 体质量不见明显增长, 治疗后5-FU组与对照组体质量相比较差异显著(P<0.05, 表1); 小鼠处死后剥离的肿瘤体积差异显著(P<0.05, 表2), 肿瘤质量5-FU组与对照组相比差异显著(P<0.05, 表2). 各组裸鼠肝脏、肺脏、胸腹腔均未见转移病灶.

表1 荷瘤小鼠治疗前后质量比较 (n = 6).
分组治疗前质量(g)P值治疗后(g)P值
阴性对照组18.61±0.5222.07±2.55
5-FU18.45±0.390.77118.48±2.92a0.024
KDR mAb18.93±1.550.58122.92±1.790.559
aP<0.05 vs 阴性对照组.
表2 治疗后肿瘤体积、肿瘤质量 (n = 6).
分组肿瘤平均体积(mm3)P值肿瘤平均质量(g)P值
阴性对照组9 398.34±7 413.961.68±0.18
5-FU1 820.32±423.21a0.0390.85±0.26a0.006
KDR mAb1 889.94±396.64a0.0501.07±0.58a0.037
aP<0.05 vs 阴性对照组.
图2
图2 荷瘤小鼠治疗后外观以及剥离瘤组织大小. A, D: 5-FU治疗组; B, E: 阴性对照组; C, F: KDR mAb治疗组; A-C: 外观; D-F: 剥离组织.
2.3 治疗后肿瘤组织VEGF

mRNA表达 KDR-mAb治疗组和5-FU治疗组VEGF mRNA表达明显低于阴性对照组(0.2383±0.052, 0.7717±0.011 vs 0.9083±0.071, P<0.01或0.05).

2.4 治疗后肿瘤组织VEGF表达

治疗后荷瘤小鼠的肿瘤组织经免疫组织化学检测, 发现阴性对照组VEGF表达阳性细胞较多, 达到(220.00±22.39)个; 5-FU治疗组VEGF表达阳性细胞数为(51.25±6.70)个, 与阴性对照组相比差异显著(P<0.05), KDR mAb治疗组VEGF表达阳性细胞数为(22.00±4.97)个, 与阴性对照组相比差异显著(P<0.05, 图3).

图3
图3 免疫组织化学法检测荷瘤小鼠肿瘤组织中VEGF表达. A: 阴性对照组; B: 5-FU治疗组; C: KDR mAb治疗组.
3 讨论

实体瘤形成过程中VEGF不仅是肿瘤血管内皮细胞生长因子[21], 同时又可以作为自分泌或者旁分泌的肿瘤细胞生长调节因子, 调控着表达KDR受体的肿瘤细胞的生长、迁移[22]. Shen等[10]报道VEGF的受体KDR和Flt-1不仅在内皮细胞上表达, 还在非内皮细胞如胎盘滋养细胞, 巨噬细胞以及恶性肿瘤细胞系中表达. KDR胞外7个Ig-样结构域对配体和受体的作用不同, 有研究报道[7-11], 针对胞外1-3区、5-7区和3区的相关片段的表达, 均抑制VEGF的活性. 目前以KDR和VEGF为靶点的抑制剂有抗VEGF抗体[23]、可溶性VEGF的受体[24]、抗KDR的抗体[25]和小分子KDR抑制剂[26]. 除了抗VEGF的抗体于2004年在美国上市以外, 其他的抑制剂均处于临床试验或临床前的阶段. 以KDR为靶点进行抗体或可溶性受体片段的表达也有报道[27-29].

KDR mAb是由本室自行研制[12], 具有与天然KDR结合的生物学活性, 抑制人脐静脉内皮细胞迁移和体外小管形成活性. 同时课题组前期研究发现胃癌患者癌组织中高表达KDR. 本研究在前期研究的工作基础上, 通过KDR mAb治疗荷人胃癌裸小鼠研究发现, KDR mAb能显著抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长, 同时能显著抑制肿瘤组织中VEGF的表达; 同时在研究过程中发现KDR mAb治疗期间小鼠精神状态良好, 饮食、饮水量正常, 与对照组无差异; 而5-FU治疗组随着治疗时间的延长, 小鼠精神萎靡, 饮食量和饮水量减少. 治疗期间, KDR mAb治疗组小鼠体质量无明显变化, 与对照组相比, 差异不显著, 但剥离的肿瘤体积和肿瘤质量与对照组差异显著, 肿瘤抑制率达到36.3%; 5-FU治疗组小鼠治疗期间体质量明显减轻, 与对照组相比差异显著, 剥离的肿瘤体积和质量与对照组相比差异显著, 肿瘤抑制率达到了49.4%. 从以上数据可以看出, 5-FU治疗组肿瘤抑制率明显比KDR mAb治疗组小鼠高, 但是5-FU治疗组随着时间的推移小鼠精神萎靡, 体质量减轻, 这是因为化疗药在杀死肿瘤细胞的对正常细胞有一定的不良反应, 对机体的毒性较大, 这与孙宁等[19]和王承党等[30]报道一致. 本研究过程中KDR mAb治疗组小鼠精神状态始终保持良好, 可能因为KDR mAb是一种生物制剂, 只针对表达KDR的肿瘤细胞和表达KDR的血管内皮细胞, 具有靶向性和特异性, 而对机体的其他正常细胞没有任何作用, 所以在整个治疗过程中, 小鼠的精神状态和体质量与对照组相比没有异常. 这些研究结果都证明该单克隆抗体具有一定的实用性, 可为进一步开发抗肿瘤血管生成药物提供基础.

志谢

感谢扬州大学兽医学院病理教研室吴力力老师和高巍老师在实验过程中给予的帮助.

评论
背景资料

异常活跃的血管发育是恶性肿瘤生长的一个重要条件. VEGF是目前已知活性最强、专属性最高的血管生成因子之一, 在肿瘤血管生成中处于核心地位. VEGF作用的发挥依赖与血管内皮细胞膜上相应受体VEGFR-1(Flt-1)和VEGFR-2(KDR)特异性结合, 认为阻断VEGF-KDR途径可以明显抑制新生血管生成.

同行评议者

关玉盘, 教授, 首都医科大学附属北京朝阳医院消化科; 肖文华, 主任医师, 中国人民解放军总医院第一附属医院肿瘤科

研发前沿

胃癌的治疗目前仍然是医学一大难题, 胃癌的靶向治疗是目前的研究热点. 随着对胃癌发生、发展和转移过程中分子生物学机制的研究, 从血管生成角度解释并预测胃癌的进展和复发, 并尝试通过抑制血管生成进行治疗. VEGF/VEGFR靶向治疗已用于肺癌、结肠癌、直肠癌等的治疗, 胃癌的治疗也正从实验室走向临床.

相关报道

孔桂美等研究显示, KDR胞外3区的mAb具有很好的生物学活性, 能明显抑制血管生成和血管内皮细胞的迁移. Gretschel等报道胃癌VEGF的表达率增高, 与癌组织血管密度增高、血管侵犯、淋巴结转移、骨髓微转移及其他远处转移、肿瘤分期有关; Lieto等显示胃癌组织中VEGF和VEGFR高表达. 孔桂美等的研究显示, KDR在胃癌组织中呈异常的阳性表达.

创新盘点

KDR在胃癌的发生、发展过程中发挥了重要的作用, 本研究显示以KDR为靶点设计抗肿瘤药物-KDR单抗, 能很好地抑制荷人胃癌裸鼠肿瘤的生长, 且具有不良反应小的特点; 进一步研究显示, KDR单抗能很好地抑制胃癌细胞和血管内皮细胞分泌VEGF.

应用要点

本文研究KDR单抗抑制荷人胃癌裸小鼠肿瘤生长的原因, 可能为以VEGF和KDR为靶点设计抗肿瘤药物, 通过阻断肿瘤血管新生, 达到抑制胃癌的生长、转移的目的.

同行评价

本研究设计合理, 结论可信, 论述清晰, 研究内容具有一定的实用性, 为进一步开发抗肿瘤血管生成药物提供了基础和新思路.

编辑:曹丽鸥 电编:何基才

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