临床经验 Open Access
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世界华人消化杂志. 2011-07-08; 19(19): 2076-2080
在线出版日期: 2011-07-08. doi: 10.11569/wcjd.v19.i19.2076
IL-23R基因多态性与炎症性肠病的相关性
陆忠凯, 陈志荣, 朱俊义, 徐亚, 华娴
陆忠凯, 陈志荣, 朱俊义, 徐亚, 华娴, 南京医科大学附属苏州市立医院(东区)消化科 江苏省苏州市 215001
基金项目: 江苏省医学重点学科-江苏省人民医院胃肠病学开放课题基金资助项目, No. KF200936-2.
作者贡献分布: 陆忠凯与陈志荣对此文所作贡献均等; 此课题由陆忠凯与陈志荣共同设计; 病例收集由陆忠凯、朱俊义、徐亚及华娴完成; 研究所用试剂与分析工具由陆忠凯与陈志荣提供; 研究过程由陆忠凯、陈志荣、朱俊义、徐亚及华娴操作完成; 数据分析及本论文写作由陆忠凯与陈志荣完成.
通讯作者: 陈志荣, 博士, 主任医师, 215001, 江苏省苏州市, 南京医科大学附属苏州市立医院(东区)消化科. zhklu@126.com
电话: 0512-62364012
收稿日期: 2011-05-05
修回日期: 2011-06-12
接受日期: 2011-06-21
在线出版日期: 2011-07-08

目的: 研究我国炎症性肠病患者IL-23R基因单核苷酸多态性特征, 探讨其与炎症性肠病(IBD)的相关性.

方法: 采用PCR扩增和测序的方法对198例IBD患者和100名健康体检者(对照组)IL-23R基因3个非同义单核苷酸多态性(rs11209026, p.Arg381Gln; rs41313262, p.Val362Ile; rs11465797, p.Thr175Asn)进行分析, 分别计算其等位基因的表现频率, 并结合临床资料评估其多态性与IBD的相关性.

结果: (1)IBD中克罗恩病(CD)患者IL-23R Arg381Gln等位基因A的表现频率为2.70%, 低于对照组(6.00%), 但无统计学差异, 溃疡性结肠炎(UC)患者的表现频率为5.65%, 与对照组无统计学差异; (2)IBD中CD患者IL-23R Val362Ile等位基因A的表现频率为2.70%, UC组为2.42%, 对照组为2.00%, 3组间无明显统计学差异; (3)IBD及对照组中均无Thr175Asn等位基因A表现, 相应位点均表现为C.

结论: 我国IL-23R单核苷酸多态性与IBD无明显相关性, 遗传异质性可能决定了IBD的易感性.

关键词: IL-23R; 单核苷酸多态性; 炎症性肠病
引文著录: 陆忠凯, 陈志荣, 朱俊义, 徐亚, 华娴. IL-23R基因多态性与炎症性肠病的相关性. 世界华人消化杂志 2011; 19(19): 2076-2080
Association between IL-23R single nucleotide polymorphisms and inflammatory bowel disease
Zhong-Kai Lu, Zhi-Rong Chen, Jun-Yi Zhu, Ya Xu, Xian Hua
Zhong-Kai Lu, Zhi-Rong Chen, Jun-Yi Zhu, Ya Xu, Xian Hua, Department of Gastroenterology, Suzhou Municipal Hospital (East Area) Affiliated to Nanjing Medical University, Suzhou 215001, Jiangsu Province, China
Supported by: the Gastroenterology Foundation of the People's Hospital of Jiangsu Province (Key Medical Discipline of Jiangsu Province), No. KF200936-2.
Correspondence to: Zhi-Rong Chen, Department of Gastroenterology, Suzhou Municipal Hospital (East Area) Affiliated to Nanjing Medical University, Suzhou 215001, Jiangsu Province, China. zhklu@126.com
Received: May 5, 2011
Revised: June 12, 2011
Accepted: June 21, 2011
Published online: July 8, 2011

AIM: To detect the association between single nucleotide polymorphism (SNP) of the interleukin-23 receptor (IL-23R) gene and inflammatory bowel disease (IBD) in Chinese patients.

METHODS: We examined three nonsynonymous SNPs in the IL-23R gene which lead to amino acid changes (rs11209026, p.Arg381Gln; rs41313262, p.Val362Ile; rs11465797, p.Thr175Asn). The SNPs were genotyped by polymerase chain reaction (PCR) and sequenced in 198 cases of IBD [124 cases of ulcerative colitis (UC) and 74 cases of Crohn's disease (CD)] and 100 healthy controls. The allele frequencies were calculated and analyzed to examine the relationship between IL-23R SNPs and IBD.

RESULTS: The frequency of the A allele in the IL-23R Arg381Gln locus showed no significant difference between CD patients and controls (2.70% vs 6.00%, P > 0.05) and between UC patients and controls (5.65% vs 6.00%, P > 0.05). The p.Val362Ile variant was present in 2.42% of UC patients, in 2.70% of CD patients, and in 2.00% of controls, with no significant difference among the three groups. The Thr175Asn (rs11465797 c.524 C>A) variant was not detected in all the three groups.

CONCLUSION: IL-23R SNPs might have no association with IBD in Chinese patients.

Key Words: Interleukin-23 receptor; Single nucleotide polymorphism; Inflammatory bowel disease
0 引言

炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)是以机体肠道的非特异性炎症反应为特征的自身免疫性疾病, 包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)和克罗恩病(Crohn's disease, CD). IBD的发病机制尚不完全明确, 但遗传因素与IBD的起病密切有关[1,2]. 近年来有研究发现IL-23R基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)可能与IBD有关, 但分歧较多. 本研究选择IL-23R 3个非同义SNPs(rs11209026 p.Arg381Gln; rs41313262 p.Val362Ile和rs11465797 p.Thr175Asn)[3]作为研究对象, 旨在探讨我国IBD IL-23R SNP的发生情况及与IBD的相关性, 从而进一步探讨IBD的发病机制, 现报道如下.

1 材料和方法
1.1 材料

收集自2005-01/2010-03来南京医科大学附属苏州市立医院住院或门诊确诊为IBD的汉族患者198例, 其中男95例, 女103例, 中位年龄44(10-89)岁. IBD诊断标准参考中华医学会IBD诊治共识意见, 其中排除合并有其他自身免疫性疾病如哮喘、类风湿性关节炎及系统性红斑狼疮等患者. 本研究取得所有患者的知情同意, 并取得南京医科大学附属苏州市立医院伦理委员会同意.

1.2 方法

1.2.1 分组: 病例分UC和CD两组, 其中UC 124例, CD 74例, 收集其临床资料及外周血样标本5 mL(EDTA-K2抗凝)以提取DNA. 收集100例健康体检血样标本作为对照组.

1.2.2 基因组DNA的制备: 以上外周血标本用DNA抽提试剂盒(Tiangen公司产品)抽提基因组DNA, 根据吸光度确定DNA产物浓度和纯度, 用去离子水稀释基因组DNA样品至50 mg/L.

1.2.3 IL-23R基因PCR反应: 参照GenBank中IL-23R序列(NC_000001.10)使用Primer 5.0设计引物以包含目的位点. rs11209026和rs41313262 的引物: 正义: 5'-GAGCAGAGTAAAGAGAATAGTAA-3', 反义: 5'-TGGGCTGAGGACTTAGCCTCTTTAAGCCTC-3', rs11465797的引物: 正义: 5'-CAAGTAACTGGGATTACAGGCACATG-3', 反义: 5'-CTTTACCTATATCATCCAGGTG-3'(上海Sangon公司合成). PCR总体系10 μL, 包含模板DNA 1 μL, 正反义引物2 μL, PCR主要混合物5 μL, 水2 μL. 反应条件: 95 ℃预变性1 min, 33个循环(95 ℃ 10 s, 60 ℃ 30 s), 72 ℃ 15 s, 4 ℃ 30 min. 目的基因片段长约461 bp和380 bp.

1.2.4 测序反应: PCR测序反应中rs11209026和rs41313262的测序引物为5'-GAGCAGAGTAAAGAGAATAGTAA-3'. rs11465797正向测序中出现T后面峰的滑动, 故进行双向测序. 测序反应条件: 96 ℃变性2 min后进行PCR循环, PCR循环参数为96 ℃ 10 s, 50 ℃ 5 s, 60 ℃ 4 min, 25个循环, 扩增结束后设置4 ℃保温. 醋酸钠/乙醇法纯化PCR产物, 电泳, 分析出测序图谱(上海纳欣生物有限公司).

1.2.5 等位基因频率计算: 使用Chromas软件根据IL-23R目的基因位点正常碱基排列序列寻找目的位点的等位基因, 并计算等位基因的表现频率.

统计学处理 计算各组等位基因频率, 确认其是否符合Hardy-Weinberg平衡定律. 多态性等位基因频率比较采用SPSS13.0软件进行卡方检验, P<0.05为具有统计学意义.

2 结果
2.1 基因组DNA检测及IL-23R基因PCR扩增产物检测

从外周血提取的人类基因组DNA, 检测A260/A280比值在1.7-1.85, 经0.8%琼脂糖凝胶电泳分析表现为>20 kb的规则条带, 无降解现象. IL-23R基因PCR扩增后产物在2%的琼脂糖凝胶电泳后有规则的461 bp和380 bp条带出现. 显示PCR扩增成功(图1, 2).

图1
图1 IL-23R(Arg381Gln/Val362Ile)扩增产物. 1: 对照组; 2: UC组; 3: CD组.
图2
图2 IL-23R(Thr175Asn)扩增产物. 1: 对照组; 2: UC组; 3: CD组.
2.2 IL-23R SNP分析

研究发现, 测序结果都为单峰的是纯合基因型, IL-23R基因rs11209026位点存在单核苷酸多态性G/A(图3), 对照组中p.Arg381Gln(A等位基因)的频率分别为6.00%, IBD中UC和CD患者的频率分别为5.65%和2.70%, CD组等位基因A的表现频率明显低于UC和正常对照组, 等位基因A可能对CD具有保护作用, 但无统计学差异(P>0.05, OR = 0.435), 而UC的等位基因频率与对照组相似, 无统计学差异.

图3
图3 IL-23R rs11209026 Arg381Gln等位基因G/A测序图. 左图该位点等位基因表现为G, 右图表现为A(方框标出).

rs41313262 p.Val362Ile存在SNP G/A(图4), 对照组中p.Val362Ile表现频率为2.00%, IBD中UC和CD患者表现频率分别为2.42%和2.70%. 3组间无明显统计学差异(P>0.05), 而3组IL-23R rs11465797 p.Thr175Asn目的位点均表现为等位基因C, 未发现等位基因A(图5, 表1).

表1 对照组及IBD患者IL-23R SNP分析.
分组nSNP n(%)
UC组vs对照组
CD组vs对照组
rs11209026(Arg381Gln)rs41313262(Val362Ile)rs11465797(Thr175Asn)P值OR值P值OR值
对照组1006(6.00)2(2.00)0(0.00)0.9100.9370.5090.435
UC组1247(5.65)3(2.42)0(0.00)1.0001.2151.0001.361
CD组742(2.70)2(2.70)0(0.00)----
图4
图4 IL-23R rs41313262(Val362Ile)等位基因G/A测序图. 左图该位点等位基因表现为G, 右图表现为A(方框标出).
图5
图5 IL-23R rs11465797(Thr175Asn)C等位基因测序图(方框标出). 未发现等位基因A.
3 讨论

IBD包括UC和CD, 是以肠道非特异性炎症为特征的自身免疫性疾病, 遗传因素在IBD发病中起重要作用[4]. 当一级亲属中有IBD患者时, IBD患病风险会增高15倍. IBD是一种多基因参与的自身免疫性疾病, 目前已研究出多个IBD易感基因位点, IL-23R就是其中之一.

IL-23R定位于染色体1p32.1-p31.2, 编码区2.9 kb, 由11个外显子组成[5]. IL- 23通过IL-23/IL-23R/Th17/IL-17途径引起肠黏膜的非特异性炎症反应[6,7]. SNP是人类可遗传的变异中最常见的一种, 占所有已知多态性的90%以上[8]. 其中非同义SNP可导致编码的氨基酸发生变化从而影响蛋白质功能, 导致疾病的发生[9]. 目前国际研究发现IL-23R存在SNP, 其中有3个非同义核苷酸多态性(rs11209026, p.Arg381Gln; rs41313262 p.Val362Ile and rs11465797 p.Thr175Asn)可导致精氨酸/谷氨酰胺、缬氨酸/异亮氨酸和苏氨酸/天冬酰胺的转变[3]. 而我国IL-23R这种SNP与IBD的相关性目前尚不明确.

Duerr等[9]曾对CD和对照人群行全基因组扫描, 结果显示IL-23R存在rs11209026, p.Arg381Gln多态性, 且与CD相关. Arg381Gln在患者家族中存在强烈的传递不平衡, 可能是IBD发病的关键. 然而国际上对IL-23R p.Arg381Gln与CD的相关性的研究结果不尽相同, Dubinsky等[10]肯定了该多态性与非犹太人儿童的CD的相关性. Amre等[11]、Borgiani等[12]和Tremelling等[13]也进一步证实了该基因多态性与加拿大、意大利及北美人群CD的相关性. 但Yamazaki等[14]、Venegas等[15]否认了其与日本及智利CD患者的相关性. 这说明IL-23R的作用在不同人群中可能具有遗传异质性.

本研究发现, 我国IL-23R基因rs11209026位点存在SNP(G/A), 我国CD患者p.Arg381Gln的表现频率为2.70%, 对照组6.00%, UC组为5.65%. CD患者p.Arg381Gln的表现频率明显低于正常对照组(OR = 0.435), 等位基因A可能对CD具有保护作用, 但统计学上均无明显差异(P>0.05). UC与正常对照组无明显差异. IL-23R p.Arg381Gln这种多态性(c.1142 G>A)使其编码的蛋白质中的一个精氨酸变成谷氨酰胺, 而谷氨酰胺是肠道黏膜生长代谢的重要营养物质, 同时具有重要的免疫调节作用, 他在维持肠黏膜屏障结构及功能中起重要作用[16], 故等位基因A可能对CD具有保护作用, 而其低表现频率可能CD发病有关. 本研究中尽管我国CD患者IL-23R p.Arg381Gln频率低于对照组, 但无统计学差异, 表明我国IL-23R Arg381Gln多态性与IBD无明显相关性, 他存在遗传异质性. 由于样本量有限, 还需更大样本进一步研究.

IL-23R另外2个非同义的SNP(rs41313262 p.Val362Ile c.1084 G>A和rs11465797 p.Thr175Asn c.524 C>A), 他可分别导致缬氨酸和苏氨酸向异亮氨酸和天冬酰胺的转变. 本研究中rs41313262 p.Val362Ile存在SNP(G/A), 对照组中p.Val362Ile的表现频率为2.00%, IBD中UC的频率为2.42%, CD患者为2.70%. 与对照组相比, UC和CD组OR值分别为1.215和1.361, 提示其多态性对IBD可能是一种危险因素, 但3组间无明显统计学差异(P>0.05), 提示其多态性与IBD发病无明显相关性. 而IL-23R rs11465797 p.Thr175Asn目的位点均表现为等位基因C, 未发现等位基因A, 表明我国IL-23R无相关多态性表现. 缬氨酸/异亮氨酸和苏氨酸/天冬酰胺可能并不参与IBD的发病, 在肠黏膜的代谢修复中可能存在可替代性.

总之, 我国的IL-23R存在SNP, 但其多态性可能与IBD无明显相关性, 遗传异质性决定了IBD的易感性. 由于样本量有限, IL-23R SNP与我国IBD确切的相关性还需进一步研究.

评论
背景资料

炎症性肠病的发病机制尚不完全明确, 其中遗传因素与炎症性肠病的发病密切有关. 目前已发现多个与IBD相关的易感基因及易感单核苷酸多态性(SNP)位点, IL-23R即是其中之一. 由于IBD发病机制复杂且存在显著种族差异性, 国际上对IL-23R的研究争议颇多, 而我国目前有关IL-23R基因多态性与IBD临床特征相关性尚不明确.

同行评议者

邢建峰, 副教授, 西安交通大学医学院

研发前沿

目前已发现多个IBD易感基因和易感SNP位点, 这也进一步证实了IBD的发病与遗传因素相关, 但目前尚未找到确切的与我国IBD明显相关的基因和SNP位点, 而这也将是今后研究IBD发病机制的热点之一.

相关报道

Duerr等报道, IL-23R存在rs11 209026, p.Arg 381Gln多态性, 且与CD相关. 然而患者家族中存在强烈的传递不平衡. IL-23R基因多态性在不同IBD患者种群中的分布及相关性尚不明确.

创新盘点

本研究首次对我国IBD患者IL-23R 3个非同义SNP进行研究, 探讨了其等位基因的表现频率分布, 了解了我国IBD患者的IL-23R基因多态性与IBD的关系.

同行评价

本文选题新颖, 对炎症性肠病的发病机制的探讨有重要的现实意义.

编辑:李薇 电编:何基才

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